SN_T 2121-2014流行性造血器官坏死检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2121--2014代替 SN/T 2121-2008流行性造血器官坏死检疫技术规范Quarantine protocol for epizootic haematopoietic necrosis2015-05-01实施2014-11-19 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局0 SN/T 2121-2014前言本标准根据GB/T1.1一2009 给出的规则起草本标准代替SN/T2121-—2008《流行造血器官坏死病检疫技术规范》。本标准与 SN/T2121-2008相比，主要技术差异如下：一增加了临床症状的描述;增加了间接免疫过氧化物酶法;一修改了综合判定。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：刘、贾鹏、郑晓聪、何俊强、马晓文、王津津、于力、史秀杰、兰文升、陈兵、王红英。本标准所代替标准的历次版本发布情况为SN/T 21211--2008.1 SN/T 2121—2014流行性造血器官坏死检疫技术规范1 范围本标准规定了流行性造血器官坏死的临床症状、病原分离、酶联免疫吸附试验、聚合酶链式反应和间接免疫过氧化物酶法的检测方法。本标准适用于流行性造血器官坏死的诊断、检测和监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出人境动物检疫采样GB19489实验室生物安全通用要求3概述流行性造血器官坏死（Epizootic haematopoietic necrosis,EHN)是一种由流行性造血器官坏死病毒（Epizootic haematopoietic necrosis virus,EHNV)引起有鳍鱼类以全身性临床或亚临床感染为特征的病毒性传染病(参见附录 A)。4试剂和材料4.1水：符合GB/T 6682中一级水的规格。4.2EHNV参考株：由指定单位提供。细胞系：选蓝鳃太阳鱼成纤维细胞系（Bluegill fry，BF-2）、胖头细胞系（Fathead Minnow，4.3FHM）、鲤鱼上皮瘤细胞系（Epithelioma Papulosum Cyprini，EPC）或大鳞大麻哈鱼胚胎细胞系(Chinook Salmon Embryo,CHSE-214)之-4.44-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）。4.5免抗EHNV抗体或鼠抗EHNV抗体：由指定单位提供。4.6辣根过氧化物酶标记的抗兔或抗鼠免疫球蛋白（IgG）。Taq DNA 酶：-20 ℃保存,避免温度剧烈变化。4.7dNTPs:含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各 10 mmol/L。4.8引物：浓度为 40 μmol/L。其序列如下：4.9M151:5-AAC CCG GCT TTC GGG CAG CA-3M152:5-CGG GGC GGG GTT GAT GAG AT-3扩增EHNV主要衣壳蛋白基因321bp片段。M153:5°-ATG ACC GTC GCC CTC ATC AC-31 SN/T 2121--2014M154:5-CCA TCG AGC CGT TCA TGA TG-3扩增EHNV主要衣壳蛋白基因 625 bp 片段。4.10异丙醇：分析纯，20℃预冷。4.11矿物油：要求无DNA酶和RNA酶，用于无热盖的PCR扩增仪。4.12 Triton X-100。5器材和设备5.1996孔细胞培养板、不同规格细胞培养瓶。5.2倒置显微镜。5.3恒温培养箱。5.4普通冰箱和一80℃超低温冰箱。5.5组织研磨器。5.6离心机和离心管。5.7PCR扩增仪。5.8水平电泳仪。5.9微量移液器及吸头。5.10紫外观察灯或凝胶成像仪。5.11制冰机。5.12高压灭菌器。5.13酶标仪。6 临床症状病鱼表现为失去平衡、体表变黑，但鳍和鳃通常无肉眼可见病变。少部分病鱼的肾脏、肝脏或脾脏肿大，肝脏有坏死灶，坏死灶可见白色病灶或黄色损伤。肾脏、肝脏和脾脏坏死表现为成片的、多点的或大面积的凝结和液化。7取样和制样7.1待检鱼的采集和处理按照GB/T18088要求取样。首选发病和死亡的鱼作为采样对象。体长大于10cm的鱼浸于70%乙醇中30s，体长小于或等于20 cm的鱼浸于70%乙醇中5s，然后用无菌水冲洗。实验室检测条件应符合GB19489的规定。7.2组织的采取和处理每5～10尾鱼作为一个小样，每个小样至少取0.1g组织。体长超过6cm的鱼，取肝、肾和脾；体长在3cm～6