SN_T 1454-2011马立克氏病检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1454—2011代替 SN/T1454—2004马立克氏病检疫技术规范Quarantine protocol for Mareks disease2011-05-31发布2011~12-01实施1097663150中华人民共和国发布30B:国家质量监督检验检疫总局码防价 SN/T 1454—2011前言本标准按照GB/T 1.1一2009给出的规则起草。本标准代替SN/鸡马立克氏病病毒分离与鉴定方法》。本标准与 SN/T 1454一-2004相比，主要技术变化如下：—加人了临床诊断内容；一琼脂免疫扩散实验的内容。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国陕西出人境检验检疫局、中华人民共和国山西出人境检验检疫局。本标准主要起草人：马玉玲、蒋宏伟、陈茂盛、巩红霞、米敬斌、高建新。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：-SN/T 1454--2004。1 SN/T 1454-2011马立克氏病检疫技术规范1范围本标准规定了马立克氏病的检疫技术要求。本标准适用于马立克氏病的流行病学调查和口岸检疫。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。一凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验夯法3缩略语下列缩略语适用于本文件。MD(mareks disease):马立克氏病MDV(MD virus）：马立克氏病病毒CEF(chick embryo fibroblasts)：鸡胚成纤维细DEF(duck embryo fibroblasts)鸭胚成纤维细胞特定病原体动物SPF(specific pathogen free) :CPE（cytopathic effect）：细胞病变4 临床诊断与判定标准4. 1 特征性发病症状在鸡群中,临床症状表现为步态不稳、共济失调，一肢或多肢的麻痹或瘫痪，并且两腿前后伸展呈“劈叉”姿势时，一般可作为 MD的示病症状,可初步判定为 MD。4.2特征性病理变化4.2.1神经型的病理变化为腰荐神经丛、坐骨神经丛、臂神经丛、颈部迷走神经丛等部位肿胀，呈半透明水肿样,色泽变淡，横纹消失，其肿胀程度一般为正常神经的2倍～3倍，且多为不对称性，通过比较对侧神经将有助于判定。4.2.2·皮肤型的病理变化为以皮肤的羽毛囊为中心,形成半球形隆起的肿瘤，其表面有时可见鳞片状棕色痴皮。4.2.3眼睛特征性病理变化是淋巴细胞浸润虹膜而导致的病理变化，虹膜呈环状或斑点状褪色，出现淡灰色；瞳孔不规则，有时偏向虹膜一侧。1 SN/T 1454—20115 实验室诊断5.1琼脂免疫扩散试验(AGID)5.1.1器材和试剂孔径 4mm 打孔器、直径90 mm平皿、5μL～50μL微量移液器和微量吸头、量桶、吸管等。1%硫柳汞溶液：硫柳汞1g，蒸馏水 100mL，溶解后置玻璃瓶盖塞备用。0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)：配制见附录 A。实验用水应符合 GB/T 6682要求。抗原和标准阳性血清：由指定单位提供,按说明书使用。琼脂板的制备：在250 mL容量的三角瓶中分别加人 pH7.4磷酸盐缓冲液 100 mL、琼脂糖1g、氯化钠8g。将三角瓶在水浴中煮沸使琼脂糖充分融化,再加人 1%硫柳汞 1mL,混合均匀，冷却至45℃～50℃,将洁净干热灭菌的直径为 90 mm 的平Ⅲ置于平台上,每个平血加人18mL～20 mL。加盖待凝固后，把平皿血倒置以防水分蒸发，放冰箱4℃中冷藏保存备用（时间不超过2周）。5.1.2样品的采集被检鸡的羽髓液：选拔含羽髓丰满的翅羽或身体其他部位的大羽数根剪下羽根部分，并按编号分别收集于相应的小试管内，向管内滴加2滴～3滴蒸馏水（羽髓丰满时也可不加），然后用玻璃棒挤压羽根，以适当的力转动玻璃棒即成。被检血清:按常规方法采血分离血清。无溶血,无细菌污染。5.1.3操作方法抗体检测.1打孔：反应孔现用现打。在已制备好的琼脂板上，按图1打孔，孔径4mm，孔间距4mm，将孔中的琼脂用7号针头斜面向上从右侧边插人，轻轻向左侧方向挑出，勿损坏孔的边缘，避免琼脂脱离底部。用酒精灯火焰轻烤平Ⅲ底部至琼脂轻微熔化为止达到封闭孔的底部，以防样品溶液侧漏。0???34图1打孔示意图.2加样：在制备好的琼脂板中的①、③、③孔中用微量移液器加人各被检血清样品，在②、④、③孔内加阳性血清,在中心孔①加入标准抗原，每孔均以加满与琼脂表面形成一个平面为度，每加一个样品应换一个吸头。.3感作：加样完毕后，加上平血盖，放人底面放置有湿纱布的带盖平底盒中，置37℃温箱中反应，分别在 24 h和 48 h观察结果。抗原