SN_T 3730.6-2013食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第6部分：猫成分检测　实时荧光PCR法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3730.6—2013食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第6部分：猫成分检测实时荧光PCR法Identification of domestic animal ingredient in food and feed-Part 6 : Detection of cat ingredient-Real-time PCR method2013-11-06 发布2014-06-01实施中华人民共和国发布0国家质量监督检验检疫总局WW.R刮涂层查真伪 SN/T 3730.6—2013前言SN/T3730《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法》共分为以下8个部分：第1部分：貂成分检测　实时荧光PCR法；第2部分：狗成分检测实时荧光PCR法；第3部分：狐狸成分检测　实时荧光PCR法；-第4部分：驴成分检测实时荧光PCR法；--第5部分：马成分检测实时荧光PCR法；第6部分：猫成分检测实时荧光PCR法；第7部分：水牛成分检测实时荧光PCR法；第 8 部分:猪成分检测　实时荧光 PCR法。本部分为SN/T3730的第6部分。本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、宝生物工程（大连)有限公司。本部分主要起草人：赵昕、李晶泉、郑秋月、张浩、王秋艳、封雪、张舒亚、韩建勋。1 SN/T 3730.6—2013食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第6部分：猫成分检测实时荧光 PCR法1范围SN/T3730的本部分规定了食品及饲料中猫成分鉴定的实时荧光PCR法。本部分适用于食品及饲料中猫成分的定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件3.1实时荧光 PCRreal time PCR在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。3.2Ct 值cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数4缩略语下列缩略语适用于本文件。4.1DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonuleic acid)4.2 dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate)4.3 CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammonium bromide)4.4Tris:三(羟甲基)氨基甲烷[tris （hydroxymethyl）aminomethane]4.5 EDTA:乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid)4.6Ex Taq HS:高效热启动 DNA聚合酶4.7 OD:光密度值(optical density)5方法提要提取样品DNA，以DNA为模板，分别采用猫成分的特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR扩1 SN/T 3730.6—2013增，观察实时荧光PCR的增幅现象，进行食品和饲料中猫成分的鉴定。6试剂和材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。6.1检测用引物（对）序列和探针：猫成分扩增引物和探针、内参照（真核生物成分）引物和探针详见表1。表 1 试验用引物和探针名称目的基因序列(5-3)内参照5端引物 TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA内参照3端引物AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT真核生物18SrRNA基因内参照探针 FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-Eclipse猫5端引物CTGCTGTCTTACTACTTCTA猫线粒体细胞色素氧化酵猫3端引物 GGTGTTTAGGTTTCGATC亚基I(COXI)基因猫探针FAM-CACTTCCAGTCTTAGCAGCGG-Eclipse6.2 CTAB 缓冲液:55 mmol/L CTAB,1 400 mmol/L NaCl,20 mmol/L EDTA,100 mmol/1. Tris,用10%盐酸调pH至8.0,121℃,高压灭菌 20 min，备用。6.3 TE 缓冲液(Tris-CI、EDTA 缓冲液):10 mmol/L Tris-HC(pH8.0),1 mmol/I EDTA(pH8.0)。6.4 蛋白酶 K:20