SN_T 3329-2012中国普氏野马的物种鉴定方法 PCR方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3329—2012中国普氏野马的物种鉴定方法PCR 方法Protocol of species identification for Equus przewalsrii-.PCR method2013-07-01实施2012-12-12 发布中华人民共和国.发布国家质量监督检验检疫总局媛查真伪 SN/T 3329-2012前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国新疆出人境检验检疫局。本标准主要起草人：郑小龙、王群、季新成、梁成珠、朱来华、邓明俊、岳志芹、肖西志、徐彪。I SN/T 3329--2012中国普氏野马的物种鉴定方法PCR 方法1范围本标准规定了中国普氏野马的物种鉴定的PCR方法，本标准适用于中国普氏野马的物种鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求3　方法原理根据普氏野马线粒体 DNA控制区(D-LQop区)设计合成1对特异性引物，对普氏野马的目的基因进行PCR扩增，判断样品中是否含有普氏野的基因。普氏野马形态特征参见附录 A。4仪器设备4.1 PCR 仪。4.2高速台式离心机。4.3台式离心机。4.4混匀器。4.5 冰箱。4.6微量可调移液器（10 μL、100 μL、1000L)及配套吸头4.7 离心管。5 试剂与材料5.1 无水乙醇。5.2蒸馏水（应符合GB/T6682中一级水的规格）。5.3 蛋白酶 K。5.4十二烷基磺酸钠(SDS)。5.5十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)。5.6 氯化钠。5.7三氯甲烷。5.8异戊醇。 SN/T 3329—20125.9 饱和酚。5.10 70%乙醇。5.11 TE 缓冲液。5.12 Taq DNA 聚合酶。5.13 dNTP。5.1410XPCR 缓冲液(Mg²+plus)。5.15琼脂糖、电泳缓冲液等(试剂配制见附录B)。5.16引物: P1: 5′-TATGTACGTCGTGCATTGAATTGTT-3′P2: 5′-AAAGAATGGGCGAG.GTTGGGTGAGG-3将引物用双蒸水稀释为 10 μmol/L，一20℃保存备用。6检测方法6.1样品的处理6.1.1血液或精液样品：可直接使用200μL新鲜、冷藏、冷冻的血液或精液。6.1.2动物组织或毛发：置于液氮中充分研磨，再将所研磨的材料放入1.5mI的离心管中。6.2样品 DNA的提取可使用等效的商品化DNA提取试剂盒，按操作说明书进行操作，也可采用以下方法提取DNA。6.2.1取血液/精液或充分研磨的组织样品，加人75μLSDS/蛋白酶K，充分混匀，65℃水浴加热10 min.6.2.2加100 μL 5mol/LNaCl和100 μL 65℃预热的 CTAB/NaCl，上下颠倒混勾,65℃水浴加热10 min.6.2.3加人700 μL的三氯甲烷：异戊醇（24：1），混匀，12000 r/min室温离心5 min。6.2.4取上层水相于新管，加人等体积的酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1），混匀，12000r/min室温离心5 min。6.2.5取上层水相于新管，加人0.6体积的异丙醇沉淀核酸，混匀，一20℃放置 30 min,12000 r/min室温离心15 min。6.2.6弃上清液，加人1000μL预冷的70%乙醇，12000r/min室温离心5min，弃上清液。6.2.7吸弃残留液体，室温干燥10min左右，用50μLTE缓冲液溶解，一20℃保存备用。6.3DNA 浓度和纯度的测定取适量DNA溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280 nm处的吸收值。DNA的浓度按照式(1)计算。c =A260 × NX 50(1)式中:c一-DNA 浓度，单位为微克每亳毫升(μg/mI.）;A260——260 nm处的吸光值;N一核酸稀释倍数。当浓度为10 μg/mL～100 μg/mL，A260 /A28o比值在1.7～1.9之间时，适宜于 PCR扩增。6.4 PCR 检测6.4.1 PCR 反应体系反应体系总体积为25 μL,其中含样品 DNA(10 μg/mL～100 μg/mL)1 μL,引物 P1和 P2(10 pmol/μL)2 SN/T 3329-2012各 0.5 μL,TaqDNA 聚合酶(5U/μL)0.15 μL,dNTP(各 2.5 mmol/L)2 μ