NY_T 2548-2014饲料中黄曲霉毒素B1的测定 时间分辨荧光免疫层析法.pdf

ICS 65.120B 25NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2548—2014时间分辨饲料中黄曲霉毒素B的测定荧光免疫层析法Determination of aflatoxin B, in feed-Time-resolved fluorescentimmunochromatographic method2014-03-24 发布2014-06-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 2548—2014前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准起草单位：中国农业科学院油料作物研究所、农业部油料及制品质量监督检验测试中心。本标准主要起草人：李培武、丁小霞、唐晓倩、张奇、张文、王督、姜俊、周海燕、张兆威。- NY/T2548—2014饲料中黄曲霉毒素B，的测定时间分辨荧光免疫层析法1范围本标准规定了时间分辨荧光免疫层析法测定饲料中黄曲霉毒素B，的方法。本标准适用于饲料和饲料原料中黄曲霉毒素B的测定。本标准黄曲霉毒素B检出限为0.30μg/kg。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理试样中黄曲霉毒素B与铕乳胶标记的特异性抗体发生结合后，抑制了层析过程中抗体与硝酸纤维素膜检测线上黄曲霉毒素B-BSA偶联物的免疫反应，使检测线时间分辨荧光强度降低，通过检测时间分辨荧光强度变化进行定量测定。4试剂除非另有规定，仅使用分析纯试剂。4.1水，按照GB/T6682中的要求，二级。4.2 甲醇(CH:(H)。4.3蔗糖(CH（))。4.4牛血清白蛋白(BSA），纯度大于98%。4.5吐温-20(CHO）。4.670%甲醇溶液：取70ml甲醇（4.2），加30ml水（4.1），混匀。4.7样品稀释液：取1.0g蔗糖（4.3）、0.5g牛血清白蛋白（4.4）和2.5g吐温-20（4.5）.溶解于100.0ml水(4.1)中。4.8铕标记黄曲霉毒素B抗体溶液：黄曲霉毒素B抗体纯度80%以上，亲和力常数不低于1.00×10°L/mol。黄曲霉毒素Bi抗体与黄曲霉毒素B、黄曲霉素Gi、黄曲霉素G交叉反应率小于10%。4.91000ng/ml.黄曲霉毒素B标准溶液。4.10100ng/ml.黄曲霉毒素B标准储备液：准确吸取黄曲霉毒素标准溶液（4.9)1ml.于10ml.容量瓶中.甲醇定容。4℃可保存3个月。警告：由于黄曲霉毒素毒性很强.试验人员应注意自我保护。操作时.应避免吸人、接触黄曲霉毒素标准溶液。标准溶液配置应在通风橱内进行.工作时应戴眼镜、穿工作服、戴医用乳胶手套。凡接触黄曲霉毒素的容器.需浸入10%次氯酸钠溶液12h以上。同时.为了降低接触黄曲霉毒素的机会本标准鼓励直接购买并使用黄曲霉毒素的有证标准储备液。5仪器设备与材料5.1时间分辨荧光检测仪：能在激发波长为（365土5）nm，检测波长为（615士5）nm条件下测定。1 NY/T2548—20145.2黄曲霉毒素时间分辨荧光免疫层析装置（图1)：固定有黄曲霉毒素-BSA偶联物.检测灵敏度不低于0.1uμg/kg.用于样品中黄曲霉毒素与铕标记抗体预反应后再与黄曲霉毒素一BSA偶联物反应的载体。(a)正视图(b)侧视图说明：-样品垫；一底板；5—-质控线；2—吸水垫：6——检测线。3—硝酸纤维素膜；图1黄曲霉毒素免疫层析装置示意图5.2.1黄曲霉毒素一BSA偶联率为(1：5)～(1：20)(BSA：AFB）。5.2.2样品垫：玻璃纤维、聚酯纤维或纸质薄片。5.2.3硝酸纤维素膜：4cm毛细时间不小于135s。5.2.4吸水纸。5.2.5底板。5.2.6连接胶带。5.3均质机.转速大于等于20000r/min。5.4分析天平：感量0.1g。5.5分样筛，20目。5.6恒温装置：温控范围为（37.0士2.0)℃。5.7漩涡混合器。5.8微量移液器：1ul~10μul.10ul~100μL,100ul~1000μl。5.9中速定性滤纸。5.10净化柱：3ml.硅胶SPE柱。5.11铕乳胶：荧光寿命≥600us。2 NY/T2548—20146分析步骤6.1试样制备：样品粉碎至全部通过分样筛（5.5），充分混合。6.2准确称取25.0g试样于烧杯中，加人100ml.甲醇溶液（4.6），用均质机（5.3）在20000r/min条件下提取2min后，静置1min，中速定性滤纸（5.9)过滤.收集滤液6.3取2.0ml.滤液过净化柱（5.10）.收集净化液。用样品稀释液（4.7)将净化液稀释至黄曲霉毒素时间分辨荧光免疫层析装置（5.2）检测范围内，漩涡混合器（5.7