SN 1554-2005鸡传染性法氏囊病酶联免疫吸附试验操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1554—2005鸡传染性法氏囊病酶联免疫吸附试验操作规程Protocol of enzyme-linked immunosobent assay for avianinfectious bursal disease2005-07-01实施2005-02-17 发布中华人民共和国发布数码防伪，国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1554—2005前 言本标准的附录A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标雅主要起草人：秦智锋、陈书、顾天钊、李环玲。本标准属首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1554—2005鸡传染性法氏囊病酶联免疫吸附试验操作规程1范围本标准规定了鸡传染性法氏囊病酶联免疫吸附试验操作方法。本标准适用于鸡传染性法氏囊病病毒抗体的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（eqvISO3696:1987)3仪器与试剂3.1仪器3.1.1酶标仪：具490nm波长滤光片。3.1.296 孔酶标板。3.1.3微量加样器:50μL、100 μL。3.1.4振荡器。3.1.537℃恒温箱。3.1.6微量离心管：1.5mL。3.1.7台式离心机。3.2试剂3.2.1试剂规格本标推所用化学试剂除另有特殊规定外，均为分析纯。试剂配制用水需满足GB/T 6682的要求。3.2.2包被液碳酸盐缓冲液,0.1mol/L,pH9.6,配制方法见第A.1章。3.2.3洗涤液含有0.05%（体积分数)Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBS-T），0.01mol/L，pH7.4，配制方法见第A.2章。3.2.4稀释液含有2.5%(质量浓度)牛血清白蛋白的PBS-T,使用当日配制。3.2.5封闭液含5%犊牛血清及0.1%Tween-20的TNE溶液,TNE溶液配制方法见第A.3章。3.2.6底物溶液含有0.04%（质量浓度)邻苯二胺及0.1%(体积分数)双氧水的柠檬酸-磷酸盐缓冲液，pH5.0,现用现配，配制方法见第A.4章。1 SN/T 1554—20053.2.7终止液2 mol/L硫酸溶液。3.3标准抗原、酶标抗体和标准血清分别为：鸡传染性法氏囊病病毒抗原;酶标羊抗鸡IgG抗体；一标准阳性血清;-标准阴性血清。4被检血清无菌条件下静脉采血1mL，分离血清，装于无菌小瓶或试管中，加贴标记后置 4℃冰箱中保存备检。5操作方法5.1包被抗原将鸡传染性法氏囊病抗原用包被液稀释到工作浓度，每孔加100μL，用塑料薄膜盖住酶标板，37℃恒温箱中温育1 h4℃过夜后备用。5.2封闭次日甩于包被液，每孔加封闭液200uL，用塑料薄膜盖住酶标板，置37℃恒温箱中温育90min。甩干后用洗涤液洗涤 3次，甩干。5.3温育用稀释液将被检血清作100倍稀释，每孔加100uL，每份血清加两孔，做平行重复试验。每板的最后一排加标准阳性血清和标准阴性血清各2孔。置37℃恒温箱中温育1h，甩干后用洗涤液洗涤3次，甩干。5.4加酶标羊抗鸡IgG抗体将酶标羊抗鸡IgG抗体用封闭液稀释至工作浓度，每孔加100μL，置37℃恒温箱中温育1h，甩干后用洗涤液洗涤3次，甩干。5.5加底物溶液每孔加新配制的底物溶液100μL,37℃避光反应10min～15min。5.6加终止液每孔加人2 mol/L硫酸溶液50μL,终止反应。5.7测定OD值用酶标检测仪于波长490nm处测定各孔的OD值，必须在加入终止液后10min内完成。6结果判定6.1判定前提当标准阳性血清与标准阴性血清的 OD值的比值大于 2时,才可进行结果判定。6.2计算P/N值待检样品的P/N比值按式(1)计算。BA=(1)C2 SN/T 1554-2005式中:A-—P/N值;B一一待检血清孔平均 OD值;一标准阴性血清平均 OD值。6.3 判定P/N比值大于等于2为阳性；小于1.5为阴性。1.5≤P/N2为可疑，可疑样品应重检一次，重检后的P/N比值大于等于1.5判为阳性，小于1.5判为阴性。3 SN/T 1554—2005附录A(规范性附录)主要试剂配方A.1包被液：碳酸盐缓冲液(0.1 mol/L、pH 9.6)甲液：碳酸钠(Na²CO:）10. 60 g加蒸馏水或去离子水至500 mL乙液:碳酸氢钠（NaHCO）16.80 g加蒸馏水或去离子水至1 000 mL甲液16 mL乙液34 mL加蒸馏水或去离子水