NY_T 2291-2012玉米细菌性枯萎病监测技术规范.pdf

CS 65.020 15NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2291-2012玉米细菌性枯萎病监测技术规范Guidelines for quarantine surveillance ofPantoea stewartii subsp. stewartii( Smith)Mergaert et al.2012-12-24发布2013-03-01实施中华人民共和国农业部-发布 NY/T言本标准按照GB/T1.1给出的规则起草。本标准由农业部种植业管理司提出。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)归口。本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、江苏省植物保护站、南京农业大学。本标准主要起草人：冯晓东、龚伟荣、胡白石、熊红利、胡婕、褚姝频、李潇楠、朱莉。I NY/T 2291-2012玉米细菌性枯萎病监测技术规范1范围本标准规定了农业植物检疫中玉米细菌性枯萎病的疫情监测、室内检验、监测记录和报告的方法。本标准适用于玉米细菌性枯萎病菌的疫情监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB15569农业植物调运检疫规程GB/T23624玉米种子产地检疫规程SN/T1375玉米细菌性枯萎病菌检疫鉴定方法3原理玉米细菌性枯菱病菌Pantoeusterwartiisubsp.steuartii(Smith）Mergaertetal.是危害玉米引起枯萎病的一种病原细菌，病害可造成严重产量损失，为进境植物检疫性有害生物。属原核生物界（Procaryotae），薄壁菌门（Gracilicutes），肠杆菌科（enterobacteriaceae），泛菌属（Pantoea）。异名：Erwinia stewartii(Smith)Dye.玉米细菌性枯萎病菌的田间症状、生理生化反应、血清学反应和PCR反应等特征是其检测与鉴定的重要依据。4试剂与材料氢氧化钾（KOH)、氯化钠（NaCI)、碘化钾（KI)、碘（I2）、草酸铵［（NH,）2CO.}、甲基红指示剂、α-萘酚、乙醇、结晶紫、蔗糖、明胶、琼脂、牛肉浸膏、蛋白陈、酵母提取物等。检验中所需的其他试剂与培养基，参见附录A。所有试剂均为分析纯。5仪器与用具超净工作台、电子天平、显微镜、培养箱、摇床、高压灭菌锅、载玻片、盖玻片、解刀、注射器、培养Ⅲ、试管和接种针等。6疫情监测6.1监测区域重点监测玉米制繁种基地、引进境外玉米种子种植区、进口玉米加工和销售场所及其周边的玉米田等高风险区域。6.2监测时间玉米整个生长期，重点监测苗期至吐丝期。6.3监测方法6.3.1踏查1 NY/T 2291—2012在玉米不同生长期，选择有代表性的田块进行踏查，观察田间玉米有无细菌性枯萎病发病症状（参见附录B），必要时可采用定点（定株）系统调查。同时调查种子来源、栽培管理及病虫害发生情况，做好记录。发现有典型或疑似症状的植株，采样进行室内检验。6.3.2系统监测选择有代表性的田块，进行田间定点定期调查，每30d调查一次，采取5点取样或随机取样方法，每点选取植物10株～20株进行调查，也可根据需要增减调查数量。疑似症状植株采样进行室内检验。6.3.3产地检疫玉米制繁种基地的疫情调查，按照GB/T23624的要求进行田间调查。6.3.4调运检疫按照GB15569的要求对调出的玉米种子进行调运检疫；对调人本地的玉米种子进行复检；并取样进行室内检验。7室内检验7.1鉴定方法7.1.1常规鉴定喷菌检查切取田间采回的植株叶片病健交界处约10mm²～20mm²，平放在载玻片的水滴中，加盖玻片后，在低倍显微镜下检查，观察有无喷菌现象。分离培养鉴定选择田间采回的具有新鲜症状的植株叶片进行病菌分离。在无菌条件下取病健交界处组织约5mm×5mm，用75%乙醇表面消毒15s，无菌水清洗2次～3次后放人0.2ml无菌水中，用灭菌玻璃棒研碎，在室温下浸泡30min。将浸出液在NA培养基平板上划线，重复3个～5个平板，（27土2)℃培养3d～5d。观察病原菌形态特征和培养特性，玉米细菌性枯萎病菌形态特征参见附录（。革兰氏染色挑取少量分离到的病原菌悬浮液，涂片固定后用草酸铵结晶紫染1min，自来水冲洗。加碘液覆盖涂面染1min后水洗，并用吸水纸吸去水分。加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30s后水洗，吸去水分。加番红花红液染10s后，自来水冲洗。干燥，镜检。若菌体都呈紫色为革兰氏阳性菌，菌体呈红色为革兰氏阴性菌。也可在载玻片上加一小滴3%KOH液。用灭菌牙签挑取少量纯培养的菌落，放入3%KOH液滴中，轻轻搅拌。5s～10s后慢慢向上提起，如有黏丝出现，则为革兰氏阴性菌；若无黏丝出现