NY_T 772-2013禽流感病毒RT-PCR检测方法.pdf

ICS 11.220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T772—2013代替NY/T772—2004禽流感病毒RT-PCR检测方法RT-PCR detection method for avian influenza virusesQT2013-09-10发布2014-01-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T772—2013前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准代替NY/T772—2004《禽流感病毒RT-PCR试验方法》。本标准与NY/T772—2004相比，主要变化如下：将原标准名称中“试验方法”改为“检测方法”；将原标准中两套操作标准，合并成一套操作标准；一将原标准中异硫氰酸胍提取RNA方法，改用商品化RNA提取试剂提取方法一一将原标准中RT-PCR检测模式，改为商品化一步法RT-PCR试剂盒的检测模式；一更新了检测H7亚型禽流感病毒的引物序列，新增通用型HA和NA基因全长的RT-PCR检测方法；更新了RT-PCR扩增产物与加样缓冲液进行混合的方法；增设检测流程，说明如何搭配使用此标准中含有的多对引物，实现不同的检测目的。本标准由中华人民共和国农业部兽医局提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国动物卫生与流行病学中心。本标准主要起草人：王秀荣、刘朔、陈继明、蒋文明、包红梅、陈化兰。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：-NY/T 772—2004。I NY/T772—2013禽流感病毒RT-PCR检测方法1范围本标准规定了禽流感病毒型特异性RT-PCR(反转录一聚合酶链式反应)检测技术（各亚型通用），以及禽流感病毒H5、H7、H9血凝素（HA)亚型和N1、N2神经氨酸酶(NA)亚型的RT-PCR检测技术。本标准适用于检测禽组织、分泌物、排泄物和禽胚尿囊液中禽流感病毒的核酸。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18936高致病性禽流感诊断技术3实验室条件3.1仪器PCR仪、台式低温高速离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、紫外凝胶成像仪、微量移液器和水浴箱等。3.2操作区域样品处理区要有相应的生物安全设施；RNA提取区和RT-PCR配液区要求高度洁净；电泳区要其他操作区域相互隔离。3.3操作者操作者应接受过RT-PCR技术培训；熟悉防止RNA降解、核酸污染和溴化乙锭污染的具体措施；熟悉RT-PCR检测结果的判断方法。4试剂的准备4.1试剂4.1.1商品化的RNA提取试剂盒。4.1.2商品化的一步法RT-PCR试剂盒。%琼脂糖凝胶，见A.1。4.1.41XTAE缓冲液：见A.2。4.1.5溴化乙锭（10μg/μL)，见A.3。4.1.6核酸电泳加样缓冲液，见A.4。4.1.7商品化的DNA分子量标准，要求在100bp～1000bp之间有5条以上的指示条带。4.1.8用已知的含有与RT-PCR检测引物(附录B)相对应的且灭活的禽流感病毒制作的阳性对照标准品（来自商品化试剂盒或者省部级以上的实验室）。4.1.9用高压灭菌的蒸馏水作为阴性对照标准品。4.2引物序列见附录B,浓度均为10umol/L，在RT-PCR反应体系的最终浓度是0.4μmol/L。1 NY/T772—20135操作程序5.1样品采集和处理按照GB/T18936中提供的方法进行。5.2对照设置每次检测每对引物，用相应的阳性对照标准品和阴性对照标准品，至少设置一个或一个以上的阴性对照和样品对照。5.3RNA提取提取的RNA应随即进行检测，否则应按照RNA提取试剂盒的说明书，提取样品和对照的RNA。于一70℃冻存。PUBLISHING5.4RNA扩增体系的配ARD例如，在RT-PCR管系法R盒说明配制按照商品化的PCNOEDRRTL、上下游引物（10PCR缓5物2中，依次加人DEPCML收测的的检述比例，将待测的昭果同时进行多个木检μmol/L)各2μL此花入44#加人6μL对应样然后每RNA以外的溶液混在起PCR管R分小用CR后需要再加用的20μL石蜡油。底部加热的PCR管加样品的RNA。对十于采厂主积为L的RT反应2有时可以选择木m5.5RT-PCR反应VAMV步是R/反转录酶最适反PCR试剂盒操作说明设置反应条件按一步法RT适反应温度是MIM转录酶最适反应温度是37些反转录酶最是50℃，反转还应温度是42°物反应条件见附录B。灭活后书转录酶，95℃、3min，第三步是PCR。各对弓第口步录时间为30m5.6RT-PCR产物电泳束尼每个RTPCR管加人5叫L核酸电泳加样缓冲液，密闭RPCR管，充分混合，RT-