SNT 2520-2010贝类中A群轮状病毒检测方法 普通CPR和实时荧光CPR方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2520—-2010贝类中A群轮状病毒检测方法普通PCR和实时荧光 PCR方法Determination of group A rotavirus in shellfish--Conventional RT-PCR and real-time RT-PCR method2010-03~02发布2010-09-16 实施中华人民共和国发布星球路191815张查询真分国家质量监督检验检疫总局，数码防伪 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准贝类中A群轮状病毒检测方法普通 PCR和实时荧光 PCR方法SN/T 2520--2010中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045网址 www. . cn电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 880×1230 1/16印张１字数 23千字2010年5月第一次印刷2010年5月第一版　印数1—1600米书号：155066·2-20848 SN/T 2520—2010前言本标准的附录 A为规范性附录,附录 B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、国家认监委认证认可技术研究所、国家质量监督检验检疫总局标准法规中心、北京金纳信生物科技有限公司。本标准的主要起草人：曾静、魏海燕、范爱红、饶红、江明、杨光、聂棱、张西萌、马旭。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。1 SN/T 2520—2010贝类中A群轮状病毒检测方法普通PCR和实时荧光PCR方法1范围本标准规定了贝类样品中 A群轮状病毒的普通 RT-PCR 和实时荧光 RT-PCR 检测方法。本标准适用于贝类中 A群轮状病毒的检测;食物中毒样品中 A群轮状病毒的检测可参照使用。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语、定义和缩略语下列术语、定义和缩略语适用于本标准。3.1术语和定义3.1.1轮状病毒rotavirus轮状病毒属于呼肠弧病毒科(Reoviridae）、轮状病毒属。病毒颗粒呈球形，直径 60 nm～80 nm，双层衣壳,无包膜，负染后在电镜下观察，病毒外形呈车轮状，故名轮状病毒。3. 1.2Ct 值 cycle threshold每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。3.1.3 magnetic nanoparticles纳米磁珠利用纳米技术将磁性材料如Fe:O4制成纳米微粒，大小介于原子簇与一般微粒子之间（直径一般小于 100 nm）,MNP的量子尺寸效应使之展现出许多特有的性质，如比表面积大、表面活性中心多、表面反应活性高、吸附能力强等，为生物和医学应用研究提供了更加科学的手段。3.2缩略语3.2.1DEPC diethyl pyrocarbonate焦碳酸乙二酯。3. 2.2MNP magnetic nanoparticles纳米磁珠。3.2.3PEG polyethylene glycol聚乙二醇。 SN/T 2520—20103.2.4RNase ribonuclease核糖核酸酶或 RNA酶。3.2.5bp base pair碱基对。4　方法原理贝类主要将病毒富集在消化腺中,取消化腺组织,加人匀浆缓冲液研磨，通过温育促进病毒粒子释放，利用PEG8000使病毒沉降，采用纳来磁珠直接从PEG8000沉降后的病毒悬液中富集病毒粒子，吸附于纳米磁珠上的病毒粒子经高温裂解，释放出病毒RNA，无需进一步纯化，直接用普通 RT-PCR 和实时荧光RT-PCR方法进行检测5 试剂所有实验用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNase容器分装；除另有说明，实验用水均为去离子水,按GB/T 6682的有关规定。5.1匀浆缓冲液：磷酸氢二钠缓冲液(pH9.6），见附录 A.1.1。5.2A群轮状病毒阳性对照样品轮状病毒阳性样本，或者选用含轮状病毒目的基因的质粒作为普通RT-PCR 和实时荧光 RT-PCR 的府性对照-轮状病毒目的基因序列参见附录第 B.1 章和第 B.2 章。5.3 PEG8000 溶液：见附录 A.1.2。5.4RNA 逆转录试剂盒:SuperS,cript (Ⅲ FiStrand Synthesis System for RT-PCR （InvitrogenCat.No