SN_T 4736-2016牛及其产品中特定转基因成分定性PCR检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4736-2016牛及其产品中特定转基因成分定性PCR 检测方法Qulitative PCR method for detecting genetically modified component incows and their derived products2017-07-01实施2016-12-12发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4736—2016前 言本标准按照GB/T 1.12009 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国农业大学、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：林祥梅、王勤、李晓琳、朱振营、刘建、王建武、孙敏、付伟、刘晓飞、梅琳、仇松寅、刘丹丹。1 SN/T 4736-2016牛及其产品中特定转基因成分定性 PCR 检测方法1范围本标准规定了牛及其产品中特定转基因成分定性 PCR检测方法。本标准适用于牛及其产品中转人乳铁蛋白基因、转人α-乳清白蛋白基因和转人溶菌酶基因的定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，,其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 20190饲料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合酶链式反应(PCR)法3缩略语下列缩略语适用于本文件。hLA:人乳清蛋白(Human Lactobumin)hLF:人乳铁蛋白(Human Lactoferrin)hLY:人溶菌酶(Human Lysozyme)PCR:聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)TE:Tris-HC1、EDTA 缓冲液Tris:三(羟甲基)氨基甲烷[Tris(hydroxymethyl)aminomethane]4定性 PCR 试验4.1主要仪器PCR 仪。.2超净工作台。4.1.3消毒灭菌锅。4.1.4凝胶成像系统。4.1.5核酸蛋白分析仪。4.1.6高速冷冻离心机，台式小型离心机，Mini个人离心机。4.1.7低温冰箱，冷藏冷冻冰箱。4.1.8纯水器，双蒸水器。4.1.9漩涡震荡器。4.1.10，电泳仪。 主要试剂4.2TaqDNA聚合酶,琼脂糖（电泳纯），三氯甲烷，异丙醇,异戊醇,70%乙醇,TE缓冲液,50 倍 TAE1 SN/T 4736—2016电泳浓缩缓冲液，细胞裂解缓冲液，蛋白酶K，醋酸钠（NaAc）。药品及试剂配制方法见附录A。4.3PCR 用引物内参照基因引物设计按照GB/T 20190，外源基因引物设计见表1，配制成10 pmol/μL用于PCR检测。表 1检测转基因牛内外基因所需的引物序列被检测基因基因来源备注引物序列扩增长度/bp牛线粒体基因5GCCATATACTCTCCTTGGTGACA3内源271内参照(β2M)5GTAGGCTGGGGAATAGTACGA35AGAGAGCACAGTGTTTGG3转人乳铁蛋白基hLF外源·5875GTCCAGCAGGTAAGTAAGG3因奶牛检测5GGTTCAGTGGTAGACAATCG3转人α-乳清白蛋hLA外源4155GGTAAGGAGAAGGAGGATGG3白基因奶牛检测5CAAATGGGAGAGTGGTTACAAC3转人溶菌hLY外源1105TGCCATCATTACACCAGTAGC3酶基因检测4.4试验步骤4.4.1样品采集无菌采集动物的组织块作为检测样品，将其放人无菌Eppendorf 管中，编号备用。采集过程中样品不得交叉污染，采集及样品前处理过程中应戴一次性手套。4.4.2样品存放对于采集的样品放置在一70℃冰箱或液氮中，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。4.4.3样品核酸的提取：取新鲜或冰冻动物组织块1g(0.5cm²），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加人1mL的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转人1.5 mL离心管中，加入蛋白酶.K（20 mg/mL）和胰 RNA酶(20mg/mL)各5 μL，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30 min，也可转人37℃水浴12 h～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12 000r/min离心5 min，取上清液转入另一离心管中。加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100μL吸头挑出，晾干，用200μLTE重新溶解（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行）。加等量的酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1）至上清液中，振荡混匀，离心12000r/min，5 min.取上层溶液至另一管，加人等体积的三氯甲烷、异戊醇（24：1），振荡混匀，离心12000r/min，5 min.取上层溶液至另一管，加人1/1