SN_T 2564-2010水产品中致病性弧菌检测 MPCR-DHPLC法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2564--2010水产品中致病性弧菌检测MPCR-DHPLC 法Detection of pathogenic Vibrio in seafood-MPCR-DHPLC2010-12-01实施2010-05-27发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2564—2010前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国西藏出人境检验检疫局。本标准主要起草人：郑秋月、曹际娟、徐君怡、于兵、郑晶、田苗、裴轶君、王金玲、于灵、王顺芝、王旭。 SN/T2564-2010水产品中致病性弧菌检测MPCR-DHPLC 法1•范围本标准规定了水产品中副溶血性弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌5种致病性弧菌的MPCR-DHPLC检测方法。本标准适用于水产品中副溶血性弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌5种致病性弧菌的快速检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T4789.7食品卫生微生物检验副溶血性弧菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检验SN/T1022出口食品中霍乱弧菌检验方法NMKLNo.156食品中致病性弧菌的检测和计数3缩略语下列缩略语适用于本文件。3. 1PCR polymerase chain reaction聚合酶链式反应。3.2MPCRmultiplex PCR多重PCR。3.3DHPLCdenaturing high performance liquid chromatography变性高效液相色谱。3. 4TEAA三乙基铵乙酸盐。4生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置。应按1 SN/T 2564—2010照GB19489的有关规定执行。5废弃物处理和防止污染的措施5.1检测过程中的废弃物需经121℃高压灭菌处理至少30min后再弃置。5.2检测过程中防止交叉污染的措施按GB/T27403规定执行。6原理多重PCR，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。DHPLC分析技术是应用离子对反相液相色谱原理对DNA片段进行分离。离子对采用三乙基胺乙酸盐缓冲溶液（TEAA），核苷酸片段分子中带负电荷的磷酸根基团与TEAA分子中带正电荷的氨基发生静电作用相互吸引，同时TEAA分子中的三个乙基与固定相C18表面的烷基发生疏水作用力而相互吸引，通过流动相中的乙睛的梯度洗脱达到将不同大小的核苷酸片段分离。7试剂和材料除另有规定外，所有试剂纯度应为色谱纯。水为灭菌超纯水；符合GB/T6682中一级水的规格。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。7.1 Tag DNA聚合酶。7.2dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP。7.310×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4),200mmol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁。7.4引物：引物序列见附录A表A.1。7.5TE溶液。7.6 10% SDS.7.7蛋白酶K(20mg/mL）。7. 8氯化钠溶液(NaCl)：5mol/L和0.7mol/L。7.910% CTAB。7. 10三氯甲烷。7.11异戊醇。7. 12酚。7. 13异丙醇。7.1470%乙醇。7.15DHPLC缓冲液：缓冲溶液A为50mLTEAA和250μL乙睛混合，加水定容至1000mL;缓冲溶液B为50mLTEAA和250mL乙腈混合，加水定容至1000mL；缓冲溶液D为75%乙睛。8主要仪器和设备8.1 PCR仪。8.2 DHPLC 仪。8.3高速离心机：离心转速18000g。8.4PCR超净工作台。2 SN/T 2564—20108.5微量可调移液器和灭菌吸头：2μL，10uL，100μL，200μL，1000μL。8.6灭菌 PCR反应管。9方法提要与检测程序9.1方法提要本方法采用水产品中5种致病性弧菌增菌或复合增菌技术，应用五重PCR同时扩增水产品中副溶血性弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌和拟态弧菌5种致病性弧菌。五重PCR产物再利用DHPLC非变性条件下的DNA分离技术，根据DNA扩增片段长度的不同，按照从小到大顺序依次洗脱核苷酸片段，