SN 1476-2004鲑鱼肾杆菌聚合酶链式反应操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1476--2004鲑鱼肾杆菌聚合酶链式反应操作规程Protocol of polymerase chain reaction (PCR) forRenibacterium salmoninarum2005-04-01实施2004-11-17 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪， SN/T 1476—2004前言本标准的附录 A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人：史秀杰、刘、高隆英、江育林。本标准为首次发布的出人境检验检疫行业标准。1 SN/T 1476--2004鲑鱼肾杆菌聚合酶链式反应操作规程1范围本标推规定了用聚合酶链式反应技术检测鲑鱼肾杆菌的方法。本标准适用于鲑鱼肾杆菌的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3试剂和材料3.1 Taq 酶--20℃保存,不要反复冻融或温度剧烈变化。3.2 dNTP含 dCTP、dGTP,dATP,dTTP各 10 mmol/L。3.3 引物-对引物,浓度为 40 μmol/L,序列为:5-CAA GGT GAA GGG AAT TCT TCC ACT-3*5-GAC GGC AAT GTC CGT TCC CGG TTT-3扩增鲑鱼肾杆菌中 p 57 蛋白的 501个碱基的 DNA 片断。3.4无水乙醇分析纯，使用前预冷到一20℃。3.5矿物油要求无DNA酶和RNA酶。3.6 水实验用水见GB/T 6682,其中用于PCR(包括核酸抽提)的水要用DEPC处理，以除去 DNA酶和RNA酶。4器材和设备PCR扩增仪、电泳仪、微量移液器及吸头、紫外观察灯、恒温培养箱、普通冰箱、低温冰箱、电动勾浆器、离心机、离心管、剪刀、镊子。5取样和制样5.1取样取出现坏死病变的肾脏或其他内脏器官。如果无组织病变，则肾脏为优先采集对象，其次是成熟雌鱼的体腔液或血细胞。鱼卵取卵黄囊膜，体长小于4 cm 的幼鱼取整条鱼，体长在4 cm～6 cm的鱼取包括肾脏在内的所有内脏。1 SN/T 1476—20045.2制样在1.5mL的 Eppendorf 离心管中加人25mg～100 mg组织或200 μL体腔液，先加人150 μLCTAB溶液（见附录第A.1章），剪碎、研磨,再用搅拌器将样品匀浆成糊状。加 CTAB到900 μI。摇匀后,25℃作用 2.5 h。6鲑鱼肾杆菌核酸的鉴定6.1DNA 抽提加600μL酚-三氯甲烷-异戊醇（见第A.3章），充分混合30s;12000r/min离心5min，取上层水相;加700μL三氯甲烷-异戊醇（见第A.2章），用力混合30s;12000r/min离心5min，取上层水相;加1.5倍体积一20℃预冷的无水乙醇,混匀后-20℃过夜以沉淀核酸(在不能及时进行 PCR检测的情况下，可置于1.5倍体积无水乙醇中，长期保存）；15000r/min离心30min，小心弃上清，立即用滤纸吸干（应尽量充分吸干）,37℃干燥约20min;加10μL水溶解后，作为PCR模板。6.2 PCR 扩增PCR反应混合物总体积100uL。含10 uLTag酶用10倍缓冲液（见第A.7章）、10 μL25mmol/L氯化镁(MgCl²)(见第 A.6章)、2 μL dNTP(各 200 μmol/L)、引物各 2.5 μL(100 pmol/L)、1 μL Taq酶(5 IU/μL)和62 μL水，然后加人10μL待测样品 DNA作为模板。最后在反应混合物上覆加50μL矿物油。混匀后稍离心，让矿物油在上层。再将反应管置于PCR扩增仪。先94℃热变性4min，然后94℃1 min-48℃ 1 min→72℃ 2 min 30 次循环,再 72℃ 10 min,最后 4℃保温。6.3设立对照在6.2中设立阳性对照、阴性对照、空白对照。取已知的标推 Renibacterium saimoninarum 菌株(由国家质量监督检验检疫总局指定单位提供)菌悬液和与鲑鱼肾杆菌相近的其他非鲑鱼肾杆菌菌悬液，用 6.1中的方法制备PCR模板，分别设立阳性对照和阴性对照;用10 μL水作为 PCR模板,设立空白对照。6.4琼脂糖电泳用TBE缓冲液（见第A.4章）配制1.5%～2%的琼脂糖板（含0.5μg/mLEB,见第A.5章），约0.5cm厚。将平板放人水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好