SN_T 4018-2014出口食品中非可培养状态细菌的检验.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4018--2014出口食品中非可培养状态细菌的检验Detection of the viable but non-culturable bacterial in foods for export2015-05-01实施2014-11-19 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4018-2014前言本标准按照GB,T1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国吉林出人境检验检疫局、吉林农业大学。本标准主要起草人：孟庆峰、王伟利、李影、宋战昀、孟日增、高云航、肖成蕊、刘阳、蔡阳、罗雁非、王振国、刘金华、魏春艳。I SN/T 4018—2014出口食品中非可培养状态细菌的检验1范围本标准规定了出口食品中非可培养状态细菌荧光显微镜观察与计数方法。本标准适用于出口食品中非可培养状态细菌的检验。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注月期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB15193.19致突变物、致畸物和致癌物的处理方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。PI:碘化丙啶。SYTO 9:花菁类绿色染料。VBNC:活的但非可培养状态。4　设备和材料4.1倒置荧光显微镜：物镜为100×/1.25的油镜头。同时，荧光显微镜配有绿色激发滤光片组块，其中激发滤光片波长为510nm~~570nm，吸收（遇止）滤光片波长为490nm。4.2载玻片与盖玻片：两者均要求无自发荧光，表面光洁，厚度0.17mm，长度大于25mm。4.3微孔滤膜：直径为25mm，孔径为0.2um，白色，表面光洁，无明显自发荧光，有亲水性。4.4　墨水：市售黑色墨水。4.5镜油：无自发光香柏油。4.6荧光染料：SYTO9终浓度为6umol/，吸收光波长为480 nm，荧光波长为610nm;PI终浓度为30μmol/I，吸收光派长为488 nm,荧光波长为630nm。5 检验程序5.1样品来源取自细菌培养阴性样品。5.2微孔滤膜疏水性检查首先将直径25:nm孔径0.2um的微孔滤膜完全浸人灭菌生理盐水中2 min，再将滤膜取出置于无菌平Ⅲ中，光面朝上，仔细观察滤膜表面。若膜表面有部分面积没有水痕，则表示此滤膜疏水，应重新更1 SN/T 4018—2014换滤膜。5.3微孔滤膜染色将检查合格的微孔滤膜光面朝上平铺于平皿中，膜与膜之间不能重叠。而后用吸管吸取适量黑色钢笔墨水，在滤膜圆心处滴一滴，要让墨水从膜中心向四周自行浸染扩散，待墨水已全部浸透膜后，将平血移至干热箱内，60℃烤膜20 min，其间需用镊子轻轻夹起滤膜翻动2次，而后冷却，室温存放备用。5.4样本荧光染色将SYTO9和PI染料配制成工作浓度（见附录A），一20℃存放备用。将5.1中样品经离心沉淀后溶于50μL灭菌生理盐水中，贴壁加人工作浓度的SYTO9和PI各25μL至离心管中，瞬间离心，吹吸混匀，室温避光染色15 min。5.5显微标本的制备将经墨水染黑的微孔滤膜置于无自发荧光的载玻片中心处，吸取10μL染色完毕样本，滴在微孔滤膜圆心上，待菌液刚好被滤膜吸于时，在其上盖上盖玻片，并用手用力压片，除尽空气夹层。最后在盖玻片上滴一滴无自发荧光的镜油，用荧光显微镜于暗室中观察并计数。荧光显微镜的激发光波长480nm，发射光波长为610nm。待检标片可置于温盒内，在4℃低温存放1d。5.6荧光显微镜观察荧光显微镜视野下VBNC状态细菌(参见附录 B)可呈现绿色荧光、菌体发生交联、直杆菌弯曲、杆菌断裂或变短、菌体聚集等状态。5.7荧光显微镜计数计数时至少随机选择10个不同视野，而每个视野中的细菌数不低于30～50个，而后取平均值。当看到呈现绿色荧光的即为活菌，而呈现红色荧光的即为死菌。只有可培养菌数为零时，所计录的绿色荧光活菌数才应算是VBNC细菌数，按式(1)进行计算。X XSiE(1)S2 XV式中：E-样品中非可培养细菌的总数，单位为个每毫升（个/mL);X一各计数视野中非可培养细菌总数的平均数，单位为个;S一滤膜的面积，单位为平方毫米（mm）;S2油镜的视野面积,单位为平方毫米（mm²）;V一过滤样品的体积，单位为毫升（mL）。6荧光染色样品的无害化处理由于PI及SYTO9具有一定的致癌作用，在检验完毕后，经荧光染料染色的废弃样品需按GB15193.19要求处理。2 SN/T 4018—2014附录A（规范性附录）溶液及培养基配制A.1 6 μmol /L SYTO 9 溶液SYTO92.856 mg，三蒸水 1L,搅拌至完全溶解，分装，一20℃避光保存。