SN_T 2101-2016出口乳及乳制品中结核分枝杆菌检测方法 荧光定量PCR法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2101-2016代替 SN/T 2101—2008出口乳及孚乳制品中结核分枝杆菌检测方法荧光定量PCR法Determination of Mycobacterium tuberculosis in milk and dairy productsfor export---Real-time PCR method2016-03-09 发布2016-10-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局刮涂层查真优 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准出口乳及乳制品中结核分枝杆菌检测方法荧光定量PCR法SN/T 2101—2016*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029)北京市西城区三里河北街16号（100045)总编室：（010址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本 880×12301/16印张 0.75字数 16千字2016年9月第2016年9月第一次印刷一版印数 1—1100*书号：155066·2-30484 SN/T 2101-2016前創言本标准按照GB/T 1.1一2009给出的规则起草。荧光定量PCR法》。本标准代替SN/T2101—2008《乳及乳制品中结核分枝杆菌检测方法本标准与 SN/T 2101-—2008相比，主要变化如下：修改了乳及乳制品中提取结核分枝杆菌的乳液处理办法；增加了确证实验；生-修改了附录B。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人：吴斌、王刚、徐凤敏、刘钊、于畅、贾赞。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：-SN/T 2101—2008。ti SN/T 2101—-2016出口乳及乳制品中结核分枝杆菌检测方法荧光定量PCR法1范围本标准规定了乳及乳制品中牛型结核分枝杆菌和人型结核分枝杆菌荧光PCR检测的操作方法。本标准适用于鲜乳、乳粉中结核分枝杆菌的检测，其他乳制品可参照执行。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 18645　动物结核病诊断技术GB19489实验室生物安全通用要求GB/T19495.2--2004转基因产品检测实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1实时荧光 PCRreal-time fluorescent PCR在普通聚合酶链反应的基础上，加人一条特异性的荧光探针。该探针为一寡核苷酸，两端分别标记-个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时,Taq 酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。3.2Ct 值 cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。3.3Triton X-100一种非离子型去垢剂。4材料和试剂4.1仪器和器材4.1.1荧光PCR检测仪。4.1.22高速台式冷冻离心机：0～20000r/min。4.1.3普通台式离心机。 SN/T 2101—20164.1.4涡旋振荡器。4.1.5冰箱:4℃±1℃,-20℃±2℃4.1.6微量可调移液器及配套带滤芯洗头:0～100 μL,0～1 mL。4.1.7量筒:0~～10 mL,0～100 ml。4.1.8吸管:l mL、10 mL,具刻度。4.1.9Eppendorf 管:1.5 mL。4.1.10离心管:10 mL。4.1.11生物安全柜。4.2试剂除特别说明以外，所用试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。4.2.1INaOH溶液（4%）：见附录 A中的 A.1。4.2.2灭菌生理盐水（0.9%）：见A.2。4.2.3蛋白酶 K(20 mg/mL):见 A.3。4.2.4SDS(10%) :见 A.4。4.2.5醋酸钠(3 mol/L,pH5.2):见 A.5。4.2.6TE缓冲液(pH8.0):见 A.6。4.2.7结核分枝杆菌卡介苗阳性样本：由中国兽医微生物菌种保藏管理中心提供。4.3抽样、采样工具采样工具（棉拭子、剪刀、镊子、注射器、离心管、研钵)121℃土2℃，,15 min高压灭菌并烘干。4.4检测引物和探针引物和探针序列见表1，参见附录B。表 1 荧光定量 PCR检测引物和探针引物和探针序列扩增片段大小(bp)上游引物 P1:5-GGTCGACACATAGGTGAGGTCT-3下游引物 P2:5’-CGCTGATCCGGCCAC-3103探针:5