SN_T 3683-2013松针褐枯病菌检疫鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3683—2013松针褐枯病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Mycosphaerella gibsoni H. C. Evans2013-08-30发布2014-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3683—2013前言本标准按照GB/T1.1一2009 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国安徽出人境检验检疫局、中华人民共和国昆山出人境检验检疫局、中华人民共和国湖北出人境检验检疫局。本标准主要起草人：姚剑、纪睿、廖太林、张萍、陈雪娇、李云飞、李刚、王振华、李百胜。I SN/T 3683—2013松针褐枯病菌检疫鉴定方法1 范围本标准规定了进出境植物检疫中松针褐枯病菌 Mycosphaerella gibsonii H.C.Evans 的检疫鉴定方法。本标准适用于来自松针褐枯病菌疫区的寄主植物苗木切枝以及松针的检疫。2松针褐枯病菌基本信息学名 :Mycosphaerella gibsonii H.C.Evans 198异名:Cercospora pini-densiflorae HoriT Nambu,Cercoseptoria pini-densiflorae (Hori Nam-bu) Deighton英文名:Brown needle blight of pine,cercospora.pineblight分类地位：松针褐枯病菌有性阶段为子囊菌门（Ascomycota），座囊菌纲（Dothidemycetes），球腔菌科（Mycosphaerellaceae），球腔菌属（Mycosphaerella）；其无性阶段为Pseudocercospora pini-densiflorae (Hori Nambu) Deighton 1987.传播途径：松针褐枯病菌通过风、雨水作近距离传播，随带菌苗木、切枝的调运作远距离传播。松针褐枯病菌的其他相关信息参见附录 A。3　方法原理1本方法遵循以松针褐枯病菌的形态特征为主，为害症状、寄主及地理分布为辅的鉴定原则。4仪器和用具仪器4.1显微镜，超净工作台，电子天平，光照培养箱,高压灭菌锅。4.2用具培养皿、烧杯、三角瓶、镊子、剪刀、移植环、载玻片、盖玻片、量筒、吸管、酒精灯。5试剂、材料和培养基5.1试剂和材料V8汁、葡萄糖、琼脂、无菌水、75%酒精、马铃薯、松针。5.2培养基V8汁加松针煎汁培养基（P-V）、马铃薯葡萄糖培养基（PDA），培养基配方见附录B。1 SN/T 3683—20136　鉴定方法6.1 症状检查检查幼苗针叶是否坏死、脱落，是否有浅绿色、黄褐色至灰色的病斑，观察病斑上有无黑点。将疑似感病样品带回实验室作进一步检验。6.2切片检验选取疑似感病样品，用剪刀剪取针叶组织（长约5mm）、切片，从中选择片薄而带有黑点部分的切片，用移植环移于载玻片中央的水滴中，在显微镜下观察子座、分生孢子梗以及分生孢子特征。如针叶病斑无子实体或子实体未成熟，可将感病针叶在25℃～30℃条件下保湿培养，待子实体长出并成熟后再做切片镜检。时间约需20d。6.3分离培养在典型病斑中切取小块病组织，在75%酒精中浸30s，用无菌水冲洗3次后置于P-V培养基上，25℃光照培养12h与0℃～10℃黑暗培养12h交替进行。经纯化培养后，观察菌落生长性状，12d后镜检。7鉴定特征7.1无性阶段分生孢子梗密集，丛生，暗褐色，直或稍弯，极少分隔，不分枝；大小2.5μm×（10μm～45μm）。分生孢子产生部位不加厚，无疤痕而具细点。分生孢子单生，淡黄褐色，长棍棒形，直或微弯，3～7分隔。基部平截或圆，不加厚，顶端钝圆：大小（20 μm～60 μm）×（2.5 μm～4.5 μm），大多数为（40!m~50 μm)X(2.5 μm~～4.5 μm)。7.2有性阶段子座暗褐色，具疣状突起，充满气孔空隙，直径60 μm～96 um。子囊双囊壁，棍棒形至圆简形，(33μm～38 μm）×（5.5 μm～7μm）;具加厚的钝圆的顶端，极少具气囊；（32 μm～36 μm）×（6 μm~8μm）；8个孢子，排成倾斜两列。子囊间组织有或无。子囊孢子无色，1个分隔，椭圆形至楔形；(7.5 μm~12.5 μm)X(1.8 μm~2.8 μm);具油滴。7.3松针褐枯病菌与同属近似种区别松针褐枯病菌与近似种松针褐斑病菌Mycosphaerella dearnessii Barr及松针红斑病菌Myco-sphaerella pini E.Rostrup 的区别参见附录 C。8结果判定如样品的切片和（或）分离培养的病菌形态特征与7.1和（或）7.2相符，即鉴