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中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1569.2—2013出口河豚鱼中河豚毒素检测方法第2部分：小鼠生物法Determination of tetrodotoxin in puffer fish for export-Part 2 : Method of mouse bioassay2013-09-16 实施2013-03-01发布中华人民共和国D发布国家质量监督检验检疫总局查真伪 SN/T 1569.2—2013前言SN/T1569《出口河豚鱼中河豚毒素检测方法》分为两个部分：第1部分:ELISA法;第2部分：小鼠生物法。本部分为SN/T1569的第2部分。本部分按照GB/T 1.1一2009给出的规则起，本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本部分主要起草人：王静、杨丽君、刘和平、李兆杰、胡巧茹、丛伟红、时文春、甄理、刘玉敏。1 SN/T 1569.2—2013出口河豚鱼中河豚毒素检测方法第2部分：小鼠生物法1范围SN/T1569的本部分规定了出口河豚鱼中河豚毒素的小鼠生物检测方法。本部分适用于出口河豚鱼中肌肉组织、肝脏、皮肤中河豚毒素的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB14925实验动物环境及设施3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1河豚毒素tetrodotoxin;TTX豚毒鱼类及其他生物体内含有的一种剧毒的生物碱，又称蝶螈毒素、东方毒素等，分子式为CHO.N3，相对分子质量319，是一种通过阻断钠离子通道抑制神经冲动的非蛋白类神经毒素。3.2毒力　toxicity药剂对特定生物发生直接作用的性质和程度。3.3鼠单位mouse unit;MU对体重为20 g的无特定病原体级（SPF)昆明系雄性小鼠腹腔注射 1 mL河豚毒素提取液，使其在30 min 内死亡所需的最小毒素量。3. 4中间致死时间median death time将小鼠死亡时间按变量值大小次序排列，居于中间位置的那个数值就是中间致死时间。4样品保存送检样品如不能立即检验，应分别用标签注明来源、取样日期、品种及编号，装塑料袋密封。抽样后样品应立即置于一18℃以下冷冻保存。5测定方法5.1方法提要根据河豚毒素易溶于酸性溶液的原理，试样制备后经2次0.5%乙酸溶液煮沸提取，20000g离心1 SN/T 1569.22013收集上清液，将2次上清液合并并定容至25mL，用于小鼠生物试验，根据小鼠注射提取液后的死亡时间，查出鼠单位，并按小鼠体重校正鼠单位。计算确定河豚毒素含量。5.2试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水符合GB/T6682中三级水的要求。%乙酸溶液:将5 mI乙酸(C,H,O,)用水稀释至1 1。5.2.2小白鼠：28日龄，体重19g～21g的无特定病原体级（SPF)昆明系雄性健康小鼠。5.3仪器和设备5.3.1均质器。5.3.2电子天平：感量0.1g。5.3.31离心机：离心力≥20000g。5.3.4秒表。5.3.5玻璃器皿：烧杯、量筒、容量瓶、搅拌等。5.3.6一次性注射器:1ml。5.3.7电炉。5.3.8 剪刀。5.3.9镊子。5.3.10手术刀。5.3.11微量移液器：1ml。5.4测定步骤5.4.1*样品中毒素的提取冷冻样品装于密封塑料袋内于流水下急速解冻：蒸留水洗净店用滤纸吸干，分解成肌肉组织、肝脏、皮肤等部分，分别称量后将各组织剪碎，充分均质。对于肌肉组织，准确称取样品10.0g于50ml.离心管中，加人0.5%乙酸溶液11mL，充分混匀，沸水浴中煮沸10min，不断搅排以防止缝织结块！冷却至室温，20000g高速离心20min，移取上清依于50ml.离心管中。向沉淀中加人0.5%乙酸溶液11mL，充分混匀，水浴中煮沸5min，不断搅拌以防止组织结块。冷却至室温，20000g高速离心20min，取上清液.将2次离心上清液合并混匀，用0.5%乙酸定容至25mL。此提取液1mL 相当于原脏器或者组织的0.4g。肝脏和皮肤的处理方法为：用0.5%乙酸处理后，不需煮沸直接20000g高速离心20min.取上清液，将2次离心上清液合并混勾，用0.5%乙酸定容至25mL。另外，因肝脏中含有大量水分，在加人乙酸提取时，应尽量减少乙酸溶液体积（8mI为宜），以防止TTX提取液稀释倍数过大。注1：制备样品时，如果样品完全解冻，取样时，组织中的毒素有可能会转移到其他组织中。因此，对于冷冻原料，要在