SNT 2332-2009国境口岸霍乱弧菌的荧光PCR检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2332—2009国境口岸霍乱弧菌的荧光PCR检测方法Detection of Vibrio cholerae with real-time PCR at frontier ports2009-07-07 发布2010-01-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局S5玛疗 SN/T 2332—2009前言本标准的附录 A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国珠海出人境检验检疫局。本标准主要起草人：朱海、莫秋华、朱玉兰、范放、杨泽、赵芳、黄李华、郑晓燕。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2332--2009国境口岸霍乱弧菌的荧光PCR检测方法1范围本标准规定了国境口岸霍乱弧菌荧光PCR检验的对象、检测程序及结果报告。本标准适用于01群霍乱弧菌菌株和0139群霍乱弧菌菌株的筛选检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注白期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方怯GB15984　霍乱诊断标准及处理原则GB19489实验室生物安全通用要求SN/T 1022出口食品中霍乱检测方法国境口岸霍乱检验规程SN/T 1239WS/T230临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用3术语和定义下列术语和定义适用于本标准3. 1荧光 PCR fluorescerchain /reaction又称为实时 PCR(real-timPCR);是在普通 PCR,的基础上利用荧光染料在激发光作用下所释放的荧光光能的变化来直接反映/PCR扩增产物量变化的新技术3.2Ct 值Icycle threshold即循环阈值，指每个反应管内所检测到的荧光信号刚好达到设定的阈值时所经历的循环数。3.3分子信标探针 molecular beacons probe分子信标探针在空间结构上呈茎环状结，其中环序列是与靶核酸互补的探针;茎序列由与靶序列无关的互补序列构成;茎的一端连上一个荧光分子，另一端连上一个淬灭分子。当无靶序列存在时,荧光信标呈茎环结构，茎部的荧光分子与淬灭分子非常接近，荧光分子发出的荧光被淬灭分子吸收并以热能的形式散发，此时检测不到荧光信号；当有靶序列存在时，荧光信标探针的环序列与靶序列特异性结合，形成的双链体比分子信标的茎环结构更稳定，荧光分子与淬灭分子分开，此时荧光分子发出的荧光不能被淬灭分子吸收，可以检测到荧光。因此实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，从而可以实时监测PCR扩增的情况。4缩略语下列缩略语适用于本标准。4.1VC Vibrio Cholerae霍乱弧菌。 SN/T 2332—20094. 2PCRPolymerase Chain Reaction聚合酶链反应。4.3dNTP deoxyribonucleoside triphosphate脱氧核苷三磷酸。4.4dATP deoxyadenosine triphosphate脱氧腺苷三磷酸。4.5dGTP deoxyguanosine triphosphate脱氧鸟苷三磷酸。4.6dCTPdeoxycytidine triphosphate脱氧胞苷三磷酸。4.7dTTPdeoxythymidine triphosphate脱氧胸苷三磷酸。4.8SDS Sodium dodecyl sulfate十二烷基硫酸钠。4. 9Tristris(hydroxymethyl)aminomethane三(羟甲基)氨基甲烷。4. 10Taq 酶 Taq DNA polymeraseTaq DNA 聚合酶。4.11PBS phosphate buffered saline磷酸盐缓冲液。4. 12TE Tris-HCI · EDTA缓冲液。5 对象5.1待检霍乱弧菌菌株。5.2霍乱感染病例或疑似霍乱感染者的排泄物、呕吐物及其增菌液。5.3被霍乱弧菌污染或有霍乱弧菌污染嫌疑的水生动物、食品、饮用水、压舱水和环境样本及其增菌液。6检测程序6.1 准备6.1.1实验室准备检验设备和材料，所需设备和材料参见附录A。实验室生物安全符合GB19489和2 SN/T 2332—2009卫生部制定的《人间传染的病原微生物名录》的规定。PCR防污染措施按WS/T 230要求。6.1.2对所采集的样本应进行唯一性标识。6.2实验室检验6.2.1样品采集、增菌培养和细菌分离鉴定按照GB15984、SN/T1239和 SN/T