SNT 2434-2010贝类包拉米虫病检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2434—2010贝类包拉米虫病检疫技术规范Protocol of quarantine for Bonamiosis in shellfish2010-01-10 发布2010-07-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 2434--2010前言本标准非等效采用了国际动物卫生组织（OIE)编写的水生动物疾病诊断手册（2006版）中2.2.1INFECTION WITH BONAMIA OSTREAE 和 2. 2. 1 INFECTION WITH BONAMIA EXITIOSA等有关章节。本标准的附录 A和附录 B为规范性附录,附录 C和附录 D为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准主要起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准参加起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国黄岛出入境检验检疫局。本标准主要起草人：吴绍强、林祥梅、刘、岳志芹、刘建、郑腾、李西峰、韩雪清、贾广乐、梅琳、王彩霞。本标准为首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2434—2010贝类包拉米虫病检疫技术规范1范围本标准规定了包拉米虫病检疫时的样品采集、组织印迹、病理切片以及PCR检测时的操作规程。本标准适用于牡蛎等水生动物及其产品中携带牡蛎包拉米虫（Bonamia ostreae）、包拉米原虫(Bonamia sp)等包拉米虫的检疫，也可用于养殖场包拉米虫病的监测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088　出人境动物检疫采样SN/T 1193基因分析检测实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3. 1包拉米虫病Bonamiasis;Bonamiosis由牡蛎包拉米虫（Bonamia ostreae）、包拉米原虫（Bonamia sp)等在宿主血细胞内寄生或者游离在结缔组织、鳃、内脏或套膜上皮中而引起的水生动物的一种严重的寄生虫病。3.2SSU rDNA小亚基核糖体DNA，为生物物种较为保守的DNA片段，常被作为物种分类及鉴定的依据。4概述包拉米虫病是严重危害世界贝类养殖业的主要疾病,也是OIE规定的贝类必报疫病之一。病原为包拉米虫，现发现的包拉米虫包括五个种，除主要寄生在欧洲牡蛎体内的牡蛎包拉米虫（B.ostreae)外，还有寄生在悉尼牡蛎体内的B.roughleyi、欧洲牡蛎体内的B.eaitiosa、美国牡蛎体内的B.perspora、澳大利亚牡蛎体内的B.sP。天然宿主包括欧洲牡蛎、新西兰牡蛎、阿根廷牡蛎、葡萄牙牡蛎、中国鹑螺，不能感染太平洋巨蛎、美洲牡蛎、河蚌等贝类。感染后症状主要表现为闭合肌萎缩、退色成黄色，颗粒性白细胞增生，出现灰白色小溃疡或穿孔性溃疡、血细胞破裂、血球渗出。性腺、套膜、鳃出现大范围损伤，并最终导致死亡。5材料除另有规定外，所用化学试剂均为分析纯。试验用水要求达到GB/T6682中一级水的要求。5.1涂有氨基烷基硅烷（aminoalkylsilane)粘附剂的载玻片。5.2姬姆萨染液、苏木精-伊红染色液、伊红染液、返蓝液、Davidsons固定液等，配制方法见附录A。5.3DNA抽提所需要的相关试剂或其他商品化组织 DNA 提取试剂盒，见附录 B。5.4PCR buffer、硫酸镁、dNTP(2.5 mmol/L 或 10 mmol/L)、DNA 聚合酶、DNA Maker、电泳上样缓Y SN/T 2434—2010冲液等，均为商品化试剂盒中成分。5.5电泳缓冲液：配制方法见附录A。5.6 二甲苯、封片树胶。5.7 无水乙醇。5.8 琼脂糖。6 设备6.1生物安全柜。6.2PCR仪。6.3电泳仪。6.4凝胶成像仪或紫外透射仪。6.5生物显微镜。6.680℃的超低温冰箱、一20l℃普通冰箱、4℃冰箱。6.7高速冷冻离心机。6.8组织研磨器。6.9高压灭菌锅。6. 10水浴锅。6.11制冰机。6. 12微量移液器及配套的吸头7检测方法采样7. 17.1.1采样点的选择应根据实际情况，一个区域的个种群至少选取3个采样点，大范围的几块不连续地区养殖易感品种,应增加采样点。采样按照GB/T18088规定方法进行。7.1.2采样技术要求有临床症状的牡蛎至少挑选10条濒死的或可疑的个体。采样时牡蛎应当是活的,牡蛎应当在活体或杀死后分别包装