SNT 2531-2010贝类和水样中札如病毒检测方法 普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2531—2010普通贝类和水样中札如病毒检测方法RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法Determination of Sapovirus in shellfish and water-Conventionai RT-PCR and real-time RT-PCR2010-09-16实施2010-03-02 发布中华人民共·和国发布国家质量监督检验检疫总局ER数码防伪 SN/T 2531-2010言前本标准附录 A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：潘良文、卢钟山、邓恬宁、吕蓉、张舒亚、李想、刘月明、高琴本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2531---2010普通贝类和水样中札如病毒检测方法RT-PCR方法和实时荧光 RT-PCR方法1 范围本标准规定了贝类和水样中札如病毒普通 RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法。本标准适用于贝类和水样中札如病毒的定性检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。SN/T 1193基因检验实验室技术要求3　术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3. 1Ct 值 cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。3.2质粒标准分子plasmid reference molecule一种包含病毒特异性 cDNA 片段的重组质粒分子,可作为病毒 PCR检测中的阳性对照。4　方法提要用合适的裂解液（如 Tri-reagent)提取贝类样品中病毒 RNA，并根据札如病毒 RNA 3’末端含有Poly(A)的结构,用连接 Oligo(dT)25的磁珠特异性吸附札如病毒 RNA 进行纯化。对水样中的病毒进行富集后,采用合适的方法提取和纯化病毒 RNA。利用普通 RT-PCR或实时荧光 RT-PCR方法进行检测。本研究通过构建质粒标准分子（每个质粒分子包含1拷贝扩增片段），确定札如病毒普通RT-PCR体系检测下限为100拷贝，实时荧光 RT-PCR体系检测下限均为10拷贝。5 试剂所有实验用试剂均为分析纯；除特别说明外，实验用水为蒸馏水或去离子水。5.1阳性标本：札如病毒，一80℃冰箱保存;或含札如病毒检测目的片段的质粒标准分子，一20℃冰箱保存。5.2甘氨酸缓冲液：见附录 A.1.1。5.3PEG 8 000溶液:见附录 A.1.2。5.4裂解液：Tri-reagent 或其他等效裂解液（如：TRIzol）。5.5Oligo(dT)25磁珠:Dynabeads-oligo(dT)2 或等效品。5.6　超纯水(无 RNase 和 DNase 污染）:见附录 A.2.3。5.775%乙醇:见附录 A.2.4。 SN/T 2531—20105.8 三氯甲烷。5.9 异丙醇。5.101XRNA吸附缓冲液:见附录 A.2.5。5.112XRNA吸附缓冲液:见附录 A.2.6:5.12漂洗缓冲液：见附录 A.2.7。5. 13 TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver 3. 0, TaKaRa,Cat. No. DRRo19A.5.14 Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time)及配套 ROX 荧光校正试剂（50 X）,TaKaRa,Cat. No.DRR039A.5.15引物和探针：根据表1和表2的序列合成引物和探针,加超纯水（无 RNase 和DNase污染）配制成10 μmol/L储备液。表1札如病毒普通RT-PCR检测引物名称序列扩增片段大小/bpSLV53175-CTC GCC ACC TAC RAW GCB TGG TT-3434SLV57495-CGG RCY TCA AAV STA CCB CCC.CA-3注: R:A/G; W:A/T;B:G/T/C; Y:C/TV:G/A/C;S:G/C表 2札如病毒实时荧光 RT-PCR检测引物和探针称引物和探针序列SaV124F--52-GAY-GAS-GCT-CTC GCY ACC TAC-3SaV1F5-TTGGCCGTC GCC ACC TAC-3引物SaV5F5}-TTT GAA CAAGCT GTG GCA TGC TAC-3Say1245R55-CCC TCC ATY TGA AAC ACT A-3SaV124TP5-FAM-CCR.CCT ATR AAC