NY_T 2916-2016棉铃虫抗药性监测技术规程.pdf

ICS 65.020B 15NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2916—2016棉铃虫抗药性监测技术规程Code of practice of insecticide resistance monitoring ofHelicoverpa armigera (Hibner)2017-04-01实施2016-10-26 发布中华人民共和国农业部5发布 NY/T 2916—2016前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由农业部种植业管理司提出并归口。本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、南京农业大学、江苏省植物保护站、山东省植物保护总站本标准主要起草人：张帅、吴益东、张浩男、杨亦桦、武淑文、翰国钢、宋姝娥I NY/T 2916—2016棉铃虫抗药性监测技术规程1 范围本标准规定了棉铃虫[Helicoverpaarmigera（Hubner)]抗药性监测的基本方法。本标准适用于棉铃虫对常用杀虫药剂及苏云金芽孢杆菌[Bucillusthuringiensis］杀虫晶体蛋白CrylAc的抗性监测。2术语和定义下列术语和定义适用于本义件。2. 1浸叶接虫法leaf-dippingbioassay将浸过药液并晾干的常规棉花叶片放在底部平铺琼脂凝胶的24孔培养板内.使棉铃虫2龄初幼虫接触和取食带药叶片的生物测定方法。2. 2毒素涂表法surface contaminationbioassay将经磷酸缓冲液溶解的Cry1Ac蛋白均匀涂布到底部平铺棉铃虫人工饲料的24孔培养板表面，使棉铃虫2龄初幼虫取食饲料表面杀虫蛋白的生物测定方法。3仪器设备3.1电子天平（感量0.1mg)。3.2打孔器（直径与24孔组织培养板孔径相同）。3.3诱虫灯。3.424孔培养板（内径15.6mm）。3.5微波炉。3.6电磁炉。3.7移液器(5ml、lml)。3.8连续分液器（5mL）。3.9量筒（500mL）。3. 10 烧杯(10 ml、25ml、100 mL、500 mL)。3.11人工气候箱：温度（26士1)℃、相对湿度（RH)（60士10）%、光照周期16h：8h(I.：D)。4试剂与材料4.1生物试材4.1.1试虫棉铃虫2龄初幼虫（初孵幼虫完成第一次蜕皮后12h以内.虫体为黑色.体重范用为1.0mg～1.5mg)。4.1.2供试植物常规棉花（不含Bt基因或其他抗虫基因）。1 NY/T 2916—20164.1.3试验人工饲料配方参见附录A。4.2试验药剂4.2.1杀虫剂原药4.2.2Cry1Ac原毒素及Cry1Ac活化毒素CrylAc原毒素制备自苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种HD-73菌株；CrylAc原毒素与胰蛋白酶（Sigma.T-8642）按照蛋白含量20：1比例于37℃水浴2h.制备Cry1Ac活化毒素。制备不同批次的Cry1Ac原毒素与活化毒素均需通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测毒素的纯度（原毒素分子量为130ku.活化毒素分子量为65ku）.并进行效价检测（在1μg/cm²剂量下对棉铃虫室内敏感品系的杀虫效果应99%)。5试验步骤5.1试虫采集与饲养利用诱虫灯从植棉区棉田诱集棉铃虫成虫50对以上，待其群体交配后，收集卵粒；或从植棉区棉田随机采集棉铃虫卵500粒以上，在室内用人工饲料饲养。以各种群的F，代幼虫作为生物测定的虫源。5.2药液配置准确称取一定量的供试杀虫剂原药，用丙酮或其他合适的有机溶剂溶解，并加人10%（mz/)用量的TritonX-100，配制成母液备用。将Cry1Ac原毒素和活化毒素溶于0.01mol/L、pH7.4的磷酸缓冲液，配成一定浓度的母液备用。5.3处理方法5.3.1浸叶接虫法采集未接触任何药剂的常规棉蕾铃期顶部展开的第三片棉叶，用打孔器打成圆片（直径与24孔组织培养板孔径相同）；将待测农药母液用0.1%TritonX-100水溶液按照等比梯度配制成5个～7个系列浓度.把圆叶片浸人药液10s后正面朝上放置在吸水纸上；将晾干后的带药叶片置于标记好的24孔组织培养板内（培养板内预先加人加热溶解后的1mL0.5%琼脂水溶液，冷却后备用），每个圆叶片正面向上放置，每孔接人1头经饥饿4h的2龄初幼虫。每个浓度处理48头，并设不含任何药剂的0.1%TritonX-100水溶液作为空白对照；接虫后的培养板用两层黑色棉布覆盖后再盖上培养板盖以防止试虫逃逸。5.3.2毒素涂表法移取60℃左右的人工饲料至24孔培养板孔底，每孔900μL，轻轻摇晃至液面平整，孔壁、孔口不得粘结饲料.室温下自然凝结；将Cry1Ac原毒素或活化毒素用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液按等比梯度稀释成5个～7个浓度梯度；待饲料冷却固化后，每孔加人100μL的毒素溶液到饲料表面，置于室温下晾干；在24孔培养板中每孔接入1头经饥饿