SN 1472-2004副结核病细菌学检查操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1472—2004副结核病细菌学检查操作规程Protocol of bacteriological examination for m ycobacterium paratuberculosis2005-04-01实施2004-11-17 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局数码防优 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准副结核病细菌学检查操作规程SN/T 1472—2004*中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045网址 www. 电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880×12301/16印张0.5字数９千字2005年2月第一版　2005年2月第一次印刷* SN/T 1472—2004前言本标准的附录A为资料性附录。本标准由国家认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山西出人境检验检疫局。本标准主要起草人：巩红霞、李卫华、廉慧锋、付英文、李惠萍。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 SN/T 1472—2004副结核病细菌学检查操作规程范围1本标推规定了副结核病细菌学检查操作技术规程，本标准适用于牛、羊和鹿副结核病的检测。2试剂和材料2.1 试剂2.1.175%酒精棉拭子。2. 1. 2 脂肪酶。%吐温-80 的 PBS液(0.5 mL吐温-80溶于100 mL pH7.0的 PBS液）。2.1.4乙醚-乙醇等分液（乙醚20 mL、乙醇20 mL混合）。2.1.5草酸、孔雀绿混合液（称取草酸10g、孔雀绿0.02g溶于100mL蒸馏水中，用孔径0.45μm滤膜过滤除菌)。2. 1.6 两性霉素 B、新霉素混合液(称取两性霉素 B5 mg、新霉素 5 mg溶于100 mL蒸馏水中,用孔径0.45μm滤膜过滤除菌）。2.1.7 0.5%胰酶水溶液。2.1.81 mol/L氢氧化钠。2.2材料2.2. 1显微镜（10×100）。2.2.2刮匙。2.2.3有铜纱网的乳钵。2.2. 4(0.45 μm滤膜)过滤器。2.2.5离心机。2.2.6 旋涡振荡器。2. 2. 7载玻片。2.2.8水浴恒温培养箱。2.2.9磁力搅拌器。3样品的采集与处理3.1样品的采集3. 1. 1 乳汁常乳在分娩后14d～25d内收集，取乳样时，先将乳头用75%酒精棉拭子擦洗消毒3次～4次，弃去前几把始乳后，约收集200mL乳样于无菌的容器中。取样应在15min内完成。3.1.2粪便选取混有粘液、血液、粘膜的粪便或用刮匙从动物直肠深部（约30cm)取少量粘液粪便，盛于灭菌容器中；也可将上述材料直接制成涂片数张，自然干燥，用防水纸包扎送检。3.1.3肠段和淋巴结选取有明显病变的肠段、回盲瓣以及病肠相邻部位的淋巴结，用自来水将粪便从肠道中漂洗掉。1 SN/T 1472—20043.1.4样品的保存及送检采集的样品可冻结保存送检，常温下的样品应在24h内送抵实验室。样品内不应加任何化学防腐剂。3.2样品的处理3.2.1乳汁的处理取牛奶样本100mL加2mg脂肪酶（1800IU/mg)37℃消化2h～3h，再加人等量的草酸、孔雀绿混合液充分混匀，37℃水浴中放30min去杂菌，并不时的振摇，5000r/min离心30min，弃上清，取沉淀物接种于马铃薯汤培养基上，或通过0.45um滤膜的过滤器，大约要滤过100mL的牛奶，移下滤膜，用少量含有0.5%吐温-80的PBS液漂洗后，取约3滴～5滴接种到马铃薯汤培养基上。并制成涂片（染色前，先用乙醚-乙醇的等分液固定并脱脂约10 min）、镜检。3.2.2粪便的处理称取粪便3g，加人灭菌生理盐水40mL充分混匀，用四层纱布过滤，滤液中加人等量的草酸、孔雀绿混合液，振摇15 min,接着2500r/min离心15 min，弃上清，再加6mL的两性霉素 B和新霉素的混合液，在旋涡震荡器上短暂混匀，室温下(20℃～22℃）孵育18h～24h,5000r/min离心30min，弃上清，取沉淀物接种于马铃薯汤培养基上，并制成涂片，火焰固定，姜-尼氏抗酸染色（参见附录A），镜检。3.2.3肠段及淋巴结的处理肠段将肠剪开，用无菌水轻轻冲洗肠内容物，于玻璃上摊开肠管，粘膜面朝上，用载玻片或外科刀刮取粘膜约10g～20g放于灭菌的带有铜纱网的乳钵中，边研磨边加人0.5%胰酶水溶液40mL使呈混悬液，并用1mol/L的氢氧化钠调pH至9.0,放在烧杯中，在磁力搅拌器上室温搅拌约1h,5000r/min离心30 min，弃上清液，取沉淀物悬浮于20mL灭菌生理盐水中，再加人等量的草酸、孔雀绿混合液，充分混匀，37℃水浴中放30min去杂菌，并不时的振摇，5000r/min离心30min，弃上清液