NY_T 2249-2012菠萝凋萎病病原分子检测技术规范.pdf

ICS 65.020B 16NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2249—2012菠萝凋萎病病原分子检测技术规范Technical specification of molecular detection for pineapple mealybug wilt pathogen2012-12-07发布2013-03-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 2249—2012前言本标准按照GB/T1.1给出的规则起草。本标准由农业部农垦局提出。本标准由农业部热带作物及制品标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。本标准主要起草人：黄俊生、王国芬、彭军、杨腊英、梁昌聪、刘磊。I NY/T2249—2012菠萝凋萎病病原分子检测技术规范1范围本标准规定了菠萝调萎病病原（包括菠萝凋萎伴随病毒和菠萝杆状病毒）的分子检测方法。本标准适用于菠萝种苗及大田植株中菠萝凋萎伴随病毒和菠萝杆状病毒的定性检测2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必可少的凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用日文件BAEUONIO本文4基因检验实验家术要SN/T1193AND33术语和定义RESEARCH下列术语和用文本人3. 1S菠萝凋萎病病原pathogenof pineapplemealybugwiltMW蒸伴随病包括菠萝青Pinea洁和菠萝杆状病毒ateduruslifoTirus.PBCov(Pineapplel活菠萝调号（PMWaV-病?21)，菠萝凋萎PMWaV-2）和波CPMWaV寓菱伴随病原的分类地售症状及地位、寄主范围~A.43. 2CENTER热休克蛋白70HSheatshockprotein分子量约子伴侣的特定构象的维ku白热休克-持等起着重要3. 3pymerase chain reaction P聚合酶链式反应CR的友高温变性为单链主DNA聚合酷下，根据模板序列设模板基因序列分DNA两条享列发生退火而互合，接着在DNA聚合计的两条引物分别与工N应的段互补核酸（dNT天物，延伸，然后酶的作用下以四种脱氧核引物得重复变性、退火和延伸这一循环，使欲扩增的基因片段以儿何倍数扩增3. 4逆转录聚合酶链式反应reverse-transeriptionpolymerasechainreaction，RT-PCRRT-PCR是先利用依赖于RNA的DNA聚合酶，将待测RNA逆转录为DNA；再以逆转录后的-段DNA作为模板，以模板DNA两端序列互补的一对特异性寡核苷酸序列作为引物，在四种脱氧核糖核苷三磷酸存在下，利用依赖于DNA的DNA聚合酶的催化作用。经过数十次变性、退火和延伸的反应循环，使模板上介于两个引物之间的DNA片段得到特异性的技术扩增，再通过电泳等手段检测到被特异性扩增的片段。3.5tRNAmet结合区tRNAmet是携带延长肽链上甲硫氨酸的tRNA，它负责识别延伸中AUG密码子。tRNAmet结合区1 NY/T 2249—2012为基因间隔区，该结合区为所有杆状病毒（Badnairus)所共有4原理根据PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3的HSP-70特有碱基序列设计特异性引物进行RTPCR扩增，依据是否分别扩增获得预期的590bp、611bp和499bp的DNA片段，判断样品中是否携带菠萝凋萎伴随病毒；根据PBCoV的tRNAmet结合区特有碱基序列设计特异性引物进行PCR扩增，依据是否扩增获得预期973bp的DNA片段，判断样品中是否携带菠萝杆状病毒。5仪器设备、用具和试剂按B.1和B.2的规定执行OPUBLISHINGA6取样ARD以田间菠萝大苗植作量为1.0g~5.0g，实取1株或芽车LASTANDA验室检测用样量为RESEARCH7检测方法?7.1PMWaVKK7.1.1检测样品方法捷参照附录PCR扩增。R的总RN7. 1. 2引物序列工引物反检测病毒CENTEA500PMWaV-1PMWaV-1PMWaV-1CDACACCAACPMWaV-2FPMWaV-2PMWaV-2RCAACPMWaV-3FPMWaV-3PMWaV-3RGXTOTCO47.1.3RT-PCR扩增RT-PCR反应体系：花叶病毒M）反酶反应缓冲液12.5分别加入10umol/L的引.PMWaVPMWaZR与PM物PMWaV-1F、PMWaVV-3F、PMWaV-3R各1.5L，加无RNA酶的超μL,RNA1μL，AMV反转录酶混25μL。RT-PCR反应条件：50℃反转录30火活反转录酶，94℃30s，不同温度退火（检测PMWaV-1退火温度为60℃，PMWaV-2和PMWaV-3退火温度为55C)1min，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸7min。取出PCR反应管