SNT 2155-2008建兰花叶病毒检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2155--2008建兰花叶病毒检测方法Identification of Cymbidium mosaic virus2008-09-04发布2009-03-16实施中华人民共和国发布FY国家质量监督检验检疫总局生15“数码防伪 SN/T 2155-2008言前本标准的附录 B、附录 C为规范性附录,附录 A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出人境检验检疫局。本标准主要起草人：相宁、张永江、杨翠云、于翠。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 SN/T 2155—2008建兰花叶病毒检测方法1范围本标准规定了建兰花叶病毒检测鉴定的基本原则和方法。本标准适用于可能带有建兰花叶病毒的所有进境兰花种苗，包括商品种苗、组培苗和脱毒苗等兰花种质的检疫和鉴定。规范性引用文件2下列文件中的条款通过本标的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法3原理建兰花叶病毒学名：Cymbidiumosaic virus,缩写:CymMV。建兰花叶病毒是侵染兰花的主要病毒之一,其血清学特性、外壳蛋白的特异性是本标准制定的主要依据,该病毒的分类地位、地理分布、寄主范围和症状、传播方式、粒体形态及基因组特征等参见附录 A。4仪器、用具及试剂4.1仪器4.1.1透射式电子显微镜。4. 1.2酶联检测仪。4. 1.3电子天平。4.1.4PCR 仪。4.1.5凝胶成像系统。4.1.6榨汁机。4.1.7高速冷冻离心机。4.1.8超速离心机。4.2用具4.2.1可调移液器（0.1μL～2 μL,２μL～10 μL,10 μL～100 μL,100 μL～000 μL)和可调移液器头。4.2.2酶联板。4.2.3Eppendorf 管。4.2.4 研钵。4.3ELISA 检测试剂4.3.1包被缓冲液(pH 9.6)碳酸钠1.59 g碳酸氢钠2.93 g0.20 g叠氮化钠溶于 900 mL蒸馏水中,用盐酸调至 pH9.6,再用蒸馏水补足1 L。 SN/T 2155—20084.3.2PBS磷酸盐缓冲液(pH 7.4)氯化钠8g磷酸二氢钾0.2 g磷酸氢二钠1.15 g氯化钾0.2 g叠氮化钠0.20 g溶于 900 mL蒸馏水中，用氢氧化钠调至pH7.4,再用蒸馏水补足1 L。4.3.3洗涤缓冲液(PBST)5 mL吐温-200PBS加至1L4.3.4样品抽提缓冲液亚硫酸钠1.3g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)20 g加至1LPBST4.3.5酶标抗体稀释缓冲液1 LPBSTPVP20 g2.0g牛血清白蛋白4.3.6底物缓冲液二乙醇胺97 mL水600 mL0.2 g叠氮化钠用盐酸调至 pH9.8,加水至1 L。5病毒检测(采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验ELISA)5.1 实验步骤5.1.1按要求的浓度或1μg/mL用包被缓冲液稀释包被抗体，每孔加100μL。将酶联板加盖或用保鲜膜包好,放在37℃孵育 2 h。5.1.2清空酶联板中溶液，用PBST加满各孔，3min后倒掉，孔向下在滤纸上拍干，再重复二次。5.1.3取1g待检测组织研碎,加入10 mL的抽提缓冲液,2 000 r/min 离心10 min后取上清液得到待检样品。分别将稀释到适当浓度的阳性对照、阴性对照和待检样品各100uL加入已包被的孔中，为保证实验的准确性，建议每个样品再设一个重复。将酶联板加盖或用保鲜膜包好，4℃下孵育过夜。5.1.4同步骤5.1.2洗板。5.1.5用酶标抗体稀释缓冲液将酶标抗体稀释到适当浓度或1μg/mL，每孔加100 μL。将酶联板加盖或用保鲜膜包好，在37℃下孵育2 h。5.1.6同步骤5.1.2洗板。5.1.7按 1 mg/mL 的浓度将 p-NPP(对硝基苯磷酸酯)溶于底物缓冲液中(使用前配制并注意避光以防变色），制成底物溶液。每孔加100μL底物溶液。将酶联板加盖或用保鲜膜包好，室温下避光孵育30 min~60 min.5.1.8在酶联仪 405 nm波长下测定或读取各孔的吸收值OD405。5.2 结果判断5.2.1如果是试剂盒，根据试剂盒的说明来判定。5.2.2对照孔的 OD405（缓冲液孔、阴性对照孔和阳性对照孔）,应在质量控制范围内，即：2 SN/T 2155—2008缓冲液孔和阴性对照孔的OD405小于0.15，当阴性对照孔的OD405小于0.05时，按0.05计算;阳性对照孔OD405/阴性对照孔OD405在5～