土壤微生物胞外酶活的测定 荧光法.pdfVIP

土壤微生物胞外酶活的测定——荧光法 1 范围 本文件规定了土壤微生物胞外酶活的测定。 本文件适用于具有荧光标记且荧光指示剂是4-甲基伞形酮 （MUB）和7-氨基-4-甲基香豆素 （AMC） 底物酶的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本 （包括所有的修改单）适用于本 文件。 ISO 10381-6: 1993 土壤质量-采样-第6分：实验室中测定好氧微生物过程的土壤样品的采集、处理 及贮存指南 （ISO 10381-6: 1993,Soil quality-Sample-Part 6:Guidanceonthecollection,handing and storage ofsoil fortheassessment ofaerobicmicrobialprocessesin thelaboratory） 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 β-葡糖苷酶 （β-Glucosidase）：BG β-木糖苷酶 （β-Xylosidase）：XYL β-乙酰葡糖胺糖苷酶 （β-N-acetylglucosaminidase）：NAG 纤维二糖葡萄糖苷酶 （B-D-cellobioside）：CBH 亮氨酸氨基肽酶 （Leucineaminopeptidase）：LAP 磷酸酶 （Alklinephosphatase）：PHOS 4 原理 解释土壤酶活性对于了解酶动力学和地下生态系统过程的动力学至关重要。由细菌和真菌产生的胞 外酶 （EEAs）参与无数的生物地球化学过程，是促进陆地生态系统养分循环的核心。 酶活性测量可以用摩尔浓度或活性表示。荧光酶测定使用来自产物的底物荧光的差异来测量酶反应。 荧光是当吸收不同波长的光后分子发出一个波长的光。荧光酶测定的一般概念是将与荧光染料结合的合 成底物加入到土壤样品中。当荧光染料通过酶催化反应从底物释放时，测量酶活性；而与较低荧光相比， 较高的荧光指示更多的底物降解。常用的合成荧光指示剂是4-甲基伞形酮 （MUB）和7-氨基-4-甲基香 豆素 （AMC）。 5 土壤采集和试剂配置 5.1 土壤样品采集及处理 应遵守土壤样品采集、处理及贮存指南 （ISO 10381-6）。具体如下：在所选定的采样区域，采用 五点取样法。先选取五个取样点，用剖面刀将取样点2-3mm表土杂物刮去，然后用土钻垂直入土5-20cm。 1 每个点的取土深度、质量应保持一致。随后将五个样点的土壤样品混匀并过2mm筛子以除去石砾和植 物残体，然后装入自封袋中密封；最后将所有采集的样品放在可移动冰箱中保存，或者放在装有冰袋的 泡沫箱中，要尽快转运到实验室4℃冰箱，及时测定。 5.2. 试剂 使用公认的分析纯试剂，包括： 5.2.1 标准物 1：荧光指示剂是4-甲基伞形酮 （MUB） 1mmol/L 的4-Methylumbelliferone 将17.5mgMUB溶于100mL使用容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL。 注：可储存冷冻-20°C长达两个月，不要解冻后重新冻结 5.2.2 标准物2：荧光指示剂7-氨基-4-甲基香豆素 （AMC) 1mmol/L 的7-Amino-4-methylcoumarin 将17.5mgAMC溶于100mL使用容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL。 注：可储存冷冻-20°C长达两个月，不要解冻后重新冻结 5.2.2NaOH 溶液 （1M） 称取NaOH 4 g，用无菌去离子水定容到100mL。 5.2.3 醋酸钠缓冲液 （50mM） 称取三水乙酸钠6.804 g 于干净烧杯中，加灭菌水至800mL，用冰醋酸调节pH 至5.0，用无菌去 离子水定容至1L。 5.2.4 50mM Tris缓冲液 将6.057gTris碱 （摩尔质量 121.14g/mol）溶解在900mL 蒸馏水中，用浓HCl 滴定至pH 8.2。 注：缓冲液应现配现用。. 5.2.5 不同底物溶液 BG：称取6.77mg用无菌水定容至100mL，棕色玻璃瓶保存 XYL：称取6.17mg用无菌水定容