SN_T 3961-2014美人蕉黄斑驳病毒的检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3961-2014美人蕉黄斑驳病毒的检疫鉴定方法Detection and identification of Canna yellow mottle virus2014-11-01实施2014-04-09发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准美人蕉黄斑驳病毒的检疫鉴定方法SN/T 3961—2014*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029)北京市西城区三里河北街16号（100045)总编室：（010址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880×12301/16印张 0.75字数 16千字2014年12月第一版2014年12月第一次印刷印数 1-1 300*书号：155066·2-27858 SN/T 3961-2014前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、福建农林大学。本标准主要起草人：沈建国、黄伙水、陈劲松、李敏、廖富荣、张永江、蔡伟、闫诚、翁瑞泉、吴祖建。I SN/T 3961—2014美人蕉黄斑驳病毒的检疫鉴定方法1范围本标准规定了美人蕉黄斑驳病毒检测的程序和方法。本标准适用于进出境植物及其产品中美人蕉黄斑驳病毒的检测。2原理美人蕉黄斑驳病毒的基因组特征是制定本检疫鉴定方法的主要依据。美人蕉黄斑驳病毒的分类地位、寄主范围、病害症状、分布地区、传播途径、粒体形态、基因组等参见附录 A。3仪器设备、用具及试剂3.1仪器设备高速冷冻离心机、电子天平（1/1000g）、实时荧光PCR、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、一20℃低温冰箱和一80℃超低温冰箱、凝胶成像分析系统、pH计、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台等。3.2用具各种量程的可调移液器（1000 μL、200 μL、100 μL、20 μL、10 μL、2 μL）、PCR 反应管、离心管(1.5 mL)、研钵等。3.3试剂巢式 PCR试剂见附录 B,实时荧光 PCR试剂见附录 C。4检测与鉴定4.1巢式PCR具体方法见附录 B。2实时荧光PCR4.2具体方法见附录C。5 结果判定与记录5.1结果判定当巢式 PCR、实时荧光 PCR两种检测方法的检测结果均呈阳性时，则判定为检出CaYMV。一当巢式 PCR、实时荧光 PCR两种检测方法的检测结果均呈阴性时,则判定为未检出CaYMV。1 SN/T 3961—2014若巢式PCR或实时荧光PCR为阳性，则需进-步采用电镜鉴定或PCR产物序列测定等方法进行鉴定。5.22结果记录记录好各项实验数据，包括样品来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。分子生物学检测结果保留电泳照片，序列测定结果保留测序报告图。6样品的保存经检测结果判定为阳性的样品应妥善保存在一20℃～一80℃超低温冰箱中，并作好登记和标记工作，以备复核用。2 SN/T 3961—2014附录A（资料性附录）美人蕉黄斑驳病毒的背景资料A.1分类地位中文名：美人蕉黄斑驳病毒学名:Canna yellow mottle virus缩写:CaYMV分类地位：花椰菜花叶病毒科（Caulimoviridae），杆状DNA病毒属（Badnavirus）。A.2寄主范围已报道的自然寄主为美人蕉。A.3 病害症状侵染美人蕉后可以产生多种症状，典型症状包括叶脉黄化、叶片产生褪绿斑、茎杆和花上出现条斑(见图 A.1)。2喜n图 A.1CaYMV 典型症状A.4分布地区主要分布于日本、美国、意大利、荷兰等国家。A.5传播途径主要通过无性繁殖材料传播。该病毒的传播介体尚未明确。3 SN/T 3961—2014A.6粒体形态病毒粒体呈杆状，长约120 nm～130 nm，直径约 28nm。A.7病毒基因组基因组为环状双链 DNA,含有 3个 ORF。4 SN/T 3961—2014附录B(规范性附录）巢式 PCR检测方法B.1 试剂B.1.1 TES:100 mmol/L Tris(pH 8.0),10 mmol/L EDTA,2%SDS.B.1.2 CTAB 提取缓冲液:20 g/L CTAB,1.4 mol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCl,20 mmol/L EDTA(pH 8.0)。B.1.3 三氯甲烷。B.1.4 异丙醇。B.1.5异戊醇。B.1.6无水乙醇。B.1.7 70%乙醇。B.1.8 蛋白酶K。B.1.9引物序列：根据已报道的CaYMV基因组序列设计2对用于特异性扩增的引物：外侧弓物 CaY