SN 1177-2003猴B病毒相关抗体检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1177—2003猴B病毒相关抗体检测方法Protocol of test for B virus related antibodies in monkey2003-03-17 发布2003-09-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1177—2003前言本标准的附录A为规范性附录。本标推由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国云南出人境检验检疫局负责起草。本标主要起草人：徐维加、董俊、周晓黎、徐自忠。本标推系首次发布的检验检疫行业标准。 SN/T 1177—2003猴B病毒相关抗体检测方法1范围本标准规定了猴B病毒相关抗体的检测方法。本标准适用于猴B病毒相关抗体的检测。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T6682—1992分析实验室用水规格和试验方法（eqvISO3696：1987)3缩略语下列缩略语适用于本标准。3.1CPE致细胞病变作用。3.2TCIDso半数组织培养感染量。3.3玻片 EIA玻片酶联免疫吸附试验。3. 4SPA葡萄球菌A蛋白。3.5HRP辣根过氧化物酶。4原理玻片EIA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特牲，也不影响酶的生物学活性。此种酶可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。5 试剂和材料下列试剂除特殊规定外，均指分析纯试剂。1 SN/T 1177--20035.1 水：本标准所用水应符合 GB/T 6682—1992 中一级水的规格。5.2病毒：人单纯疱疹病毒I型(HSV-1)毒株，由指定单位提供。5.3血清:人单纯疱疹病毒 I型阳性血清、阴性血清由指定单位提供。5.4被检血清。细胞：Vero传代细胞，由云南出入境检验检疫局提供。5.55.6SPA-酶(辣根过氧化物酶）（见第A.2章）：由指定单位提供。5.7培养液：199培养基中加人10%无HSV-1抗体的胎牛血清（经56℃ 30min灭活）含青霉素200 IU/mL、链霉素 200 μg/mL。5.8维持液和稀释液：199培养基中加人2%无HSV-1抗体的胎牛血清（经56℃ 30min灭活）含青霉素 200°IU/mL、链霆素 200 μg/mL。5.9细胞分散液、终止液、底物液、缓冲液(pH7.3)、0.25%胰酶等（见附录A：第A.5章、第A.1章、第A.4章、第A.3章、第A.6章）。6器械和设备6.1倒置显微镜、普通显微镜、二氧化碳培养箱、冰箱（一20℃保存血清、一70℃保存种毒）。6.2玻片（印有10～40个小孔）、微量移液器（20 μL～200 μL)。7 玻片 EIA7.1操作方法7.1.1抗原玻片制备：HSV-1感染Vero细胞，出现“50%～75%”病变时弃去溶液加人少量0.25%胰酶和0.02%EDTA各半进行消化，见细胞松散弃去消化液，用PBS洗一次，加人少量PBS吹打细胞使其分散均勾。将细胞液滴在玻片孔内，在显微镜下观察，细胞分散，浓度适中即可。待于，放人冷丙酮置4℃，15min取出吹干。同时制备正常细胞抗原，方法同上。涂好的玻片放人一30℃保存。保存期间需保持干燥。7.1.2SPA-HRP的滴定：用涂好的玻片，滴加1：10 的阳性血清于正常细胞和病毒细胞的孔内，另滴加阴性血清和 PBS作对照。将酶结合物按一定的稀释度稀释,最后选择出现“十十十～十十十十”最高稀释度为正式试验酶结合物的稀释度。7.2试验程序7.2.1将已准备好的涂有病毒细胞和正常细胞的玻片取出,待干,分别加上 1：5稀释的待检血清及已知阳性、阴性血清和PBS,滴好后将玻片放人湿盒,37℃保温30 min。7.2.2取出玻片用洗液漂洗三次,每次浸泡 5 min,待干。7.2.3加酶结合物，放湿盒内保温30min。7.2.4用洗液漂洗三次，每次5 min,待干。将玻片放入底物液显色5.min。.6 置水内洗一次,终止反应后,待干。7.3结果判定首先看正常细胞孔的阳性血清孔、阴性血清孔、PBS孔无色；病毒细胞孔的阴性血清孔、PBS孔无色，阳性血清孔有色时才可判定结果。或者正常细胞孔略有颜色，而病毒细胞孔的颜色明显高于正常细胞孔也可判定结果。如果待检血清的正常细胞孔和病毒细胞孔颜色一样则不