SN_T 4782-2017出口食品及调味品中罂粟成分检测方法 实时荧光PCR法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4782—2017出口食品及调味品中罂栗成分检测方法实时荧光PCR法Detection of Papaverin export food and condiment-Real time PCR method2017-05-12 发布2017-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局刮涂层查真伪” SN/T 4782—2017前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国安徽出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、上海市质量监督检验技术研究院。本标准起草人：杨捷琳、高琴、宗凯、刘洋、刘月明、吕蓉、李想、潘良文、何宇平。1 SN/T 4782—2017出口食品及调味品中罂栗成分检测方法实时荧光 PCR 法1 范围本标准规定了食品及调味品中罂粟成分检测的实时荧光PCR方法。本标准适用于食品及调味品中粟成分定性检测。本标准所规定方法的最低检出限（LOD)为0.01%（质量分数）。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T27403实验室质量控制规范·：食品分子生物学检测SN/T 1193基因分析检测实验室技术要求3术语和定义下列术语及定义适用于本文件。3.1翼粟 Papaver somniferum L按《中国植物志》，特指鸦片罂粟，为一种直立的一年生罄粟属草本植物。4　方法提要本标准采用实时荧光PCR特异性检测食品及调味品中罂粟成分。设计了针对罂粟小檗碱桥酶基因的特异性引物探针，采用Taqman实时荧光方法进行检测。5 试剂和材料5.1 引物及探针(罂粟小檗碱桥酶基因 Papaver somniferum berberine bridge enzyme bbel):上游引物:5-GTTCTTAGGCTTACACTTGGGACG-3;-下游引物:5-ACCGGGCTGTTCTGATAACATCT-3;-探针:FAM-TTTCAAGAAATGAGTTGGGGTGAATCC-BHQ1。5.2 石油醚。5.3 CTAB 提取缓冲液:20 g/L CTAB,1.4 mol/L NaCl,0.1 mol/I Tris-HCl,0.02 mol/L Na2 EDTA,pH 蛋白酶 K(20 mg/mL)。5.5　三氯甲烷(氯仿)。5.6CTAB沉淀液:5 g/L CTAB,40 mmol/L NaCl。1 SN/T 4782--20175.7 1.2 mol/L NaCI 溶液。5.8异丙醇。5.9 70%乙醇。5.10质控物质：罂粟阳性物质。6仪器和设备6.1实时荧光PCR仪。6.2恒温水浴锅。6.3均质器。6.4涡旋震荡器。6.5离心机：最大转速16000g。6.6 移液器:2.5 μL、20 μL、200 μL、1 000 μL。6.7核酸浓度测定仪。6.8大体积浓缩仪。7检验步骤7.1样品前处理7.1.1一般样品取25g样品，研磨均质，称取200mg样品至2mL离心管中，按照步骤7.2提取DNA。7.1.2高油脂含量样品称取250g样品（预包装产品可加热溶解），倒人500mL烧杯中，静置1h～2h，样品可分为3层，上层是油脂，中间是水相，下层是固体残渣。去除上层油脂，吸取水相到分液漏斗中，加入100mL石油醚（5.2)，震荡5min后静置，收集下层水相。采用大体积浓缩仪，40℃～60℃抽真空及低速离心条件下,将水相浓缩至 1 mL～5 mL。取浓缩后水相与固体残渣混合,转移到 100 mL烧杯中,研磨均质,取200 mg到2 mL离心管中,采用 7.2方法提取 DNA。7.2　DNA 提取按照下述CTAB法提取DNA，也可采用等效的DNA提取试剂盒。在样品中加人1mLCTAB提取缓冲液（5.3）和20μuL蛋白酶 K（5.4)溶液，混匀，65℃水浴1h。10000g离心10min，取上清转移至2ml离心管中，加人700μL氯仿（5.5），涡旋震荡30s混匀。10000g离心10min，收集上清至新的2mL离心管中，加人2倍体积的CTAB沉淀液（5.6），室温放置60min。10000g离心10min，弃上清。沉淀溶于350μL1.2mol/LNaCl溶液（5.7），涡旋震荡30s溶解沉淀。加人350μL氯仿，涡旋震荡30 s混匀，10 000g离心10min。将上清转移至新的离心管中，加人0.8倍体积的异丙醇（5.8），室温放置25min。10000g离心10 min，弃上清，加人500μuL70%乙醇(