SN_T 3497-2013水产品中颚口线虫检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3497—2013水产品中颚口线虫检疫技术规范Quarantine protocol for Gnathostoma in aquatic products2013-03-01发布2013-09-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3497—2013前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、广西大学、广西壮族自治区疾病预防控制中心、中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所、中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局。本标准主要起草人：李树清、黄维义、张鸿满、陈韶红、李雯雯、吴慧芳、李健、张永年、张子群、陈志飞、王巧全、张强、王艳- SN/T 3497--2013水产品中颚口线虫检疫技术规范1 范围本标准规定了颚口线虫第三期幼虫的形态学鉴定和PCR检测方法。本标准适用于水产品中颚口线虫的检疫、流行病学调查和监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注月期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样3概述颚口线虫病（Gnathostomiasis）是由颚口线虫（Gnathostoma）引起的人兽共患寄生虫病。人主要因生食或食入未熟的含有颚口线虫第三期纺虫的水产品而导致题口线虫病。颚口线虫的分类、生活史、分布参见附录A。4设备和材料4. 1仪器和器材4.1.1生物显微镜。4.1.2体视显微镜。4.1.3PCR扩增仪。4.1.4电泳仪。4.1.5凝胶成像系统。4.1.6网筛(10目）。4. 2试剂和溶液4.2.1Tag酶(5 U/μL)。4.2.22. 5 mmol/L dNTP。4.2.325mmol/LMgClz。4.2.410×PCR缓冲液（无Mg2+）。4.2.5分子量指示物：100bp~2000bpDNAmarker。面4.2.650%和70%乙醇。4.2.7水，符合GB/T6682中一级水的规定。4.2.8人工消化液、乳酸苯酚透明液、Tris-乙酸电泳缓冲液（TAE）、琼脂糖凝胶、6×加样缓冲液（配制见附录B)。4.3引物扩增颚口线虫核糖体DNA第二内转录间隔区（ITS2)引物序列为：1 SN/T 3497—2013上游引物NEWS2:5-TGTGTCGATGAAGAACGCAG-3。下游引物RIXO:5-TTCTATGCTTAAATTCAGGGG-3。5检验步骤5.1样品采集临床上采集的样品为鱼类、两栖类、爬行类等水产品，鱼类主要是淡水鱼，如鳝鱼、泥鳅等，采样比例按照GB/T18088执行，5.2样品处理取样品250g，剪成小块，按照样品与人工消化液1：5的比例加人消化液，于37℃消化至无可见的肉组织。消化后的悬液用10目网筛过滤，滤液置于锥形量简内，加水至量简的最大刻度处，沉淀洗涤至水清。全部沉渣吸人玻璃平Ⅲ，用体视显微镜观察，挑出所见的虫体。用生物显微镜按照5.3.1进行颚口线虫属的鉴定，然后将虫放人70℃的50%乙醇中固定使虫体伸直，冷却后移入70%乙醇中保存。5.3颚口线虫第三期幼虫的形态学鉴定5.3.1颚口线虫属的形态学鉴定颚口线虫第三期幼虫有头球，头球上有3～4环小钩，每环钩数约40个；有4个颈霆；体表有横纹和环列的小棘，体前部棘数明显且密，体后部棘渐小且疏；食道星棒状，分肌质部和腺质部；肠管粗大。根据这些特征可以判定为颚口线虫属第三期幼虫，第三期幼虫的模式及实物图参见附录C。如果需要鉴定到种，再继续下面的程序。5.3.2颚口线虫种的形态学鉴定虫体透明将5.2中乙醇保存的虫体放人乳酸苯酚透明液中，待虫体由白色变为透明，挑出放在载玻片上.并盖上盖玻片，在显微镜下观察，按照判定。观察结束后，用70%乙醇将虫体洗涤至白色后，放回70%乙醇，4℃保存。虫种形态学判定根据第三期幼虫虫体大小；头球大小、头球基板形态、头球披列每环小钩的数目和形态；颈乳突、排泄孔的位置；以及体表棘的环列数进行颚口线虫虫种的初步鉴定。常见的致病颚口线虫虫种第三期幼虫的形态特征见附录D。由于颚口线虫第三期幼虫在不同的宿主体内·长度有很大的差异，各虫种之间头球大小、头球披列每环小钩的数目、颈乳突的位置等相似，形态特征只能对虫种进行初步鉴定.需要结合分子生物学方法进行进一步的鉴定。5.4颚口线虫的分子生物学鉴定5.4.1DNA提取DNA提取可选用等效的商品化试剂盒，下面依据QIAGEN公司的DNA抽提试剂盒1）使用QIAGEN公司的DNA试剂盒进行描述只是为了叙述方便，并不代表推荐QIAGEN的产品，标准的使用