hplc-pda法测定小柴胡汤中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素和甘草酸的含量.docxVIP

hplc-pda法测定小柴胡汤中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素和甘草酸的含量 小柴胡汤是汉代张仲景《伤寒论》中关于少阳病的主要方剂。它也是八个法律中“和”法的代表方。具有解表散热,疏肝和胃的功能,临床上以寒热往来、口苦咽干、胸胁苦满、舌苔薄白、弦脉为辨证要点,为和解少阳之代表方剂。 根据2005年版《中国药典》一部,小柴胡汤由柴胡、黄芩、党参、半夏、甘草、生姜、大枣7味药组成。有关小柴胡汤中有效成分的含量测定,目前多数文献报道是通过 HPLC 测定其中单个有效成分的含量,或者是测定其中黄芩苷和甘草酸的含量。要科学、客观地评价小柴胡汤的质量和深入地研究小柴胡汤药效物质基础,应尽可能多的测定其中有效成分的含量。 本研究建立起了利用HPLC同时测定小柴胡汤中黄芩苷(baicalin,BCN)、黄芩素(baicalein,BCE)、汉黄芩苷(wogonoside,WGS)、汉黄芩素(wogonin,WGN)、 甘草酸(glycyrrhizic acid,GA)5种有效成分含量的方法。 1 试剂与仪器 Waters高效液相色谱仪(2695-2996),Empower Pro色谱数据工作站。超纯水系统(Millipore),CP-225D型精密电子天平(Sartorius),PB-10酸度计(Sartorius)。 BCN(批号110715-200815),BCE(批号111595-200604),WGN(批号111514-200403)和甘草酸单铵盐(ammonium glycyrrhizinate,AG,批号110731-200615)对照品均购自中国药品生物制品检定所,WGS(四川维克奇生物科技有限公司,批,乙腈为色谱纯(美国,fisher);甲醇为色谱纯(德国,Merck);磷酸为分析纯(成都市科龙化工试剂厂);水为Millipore系统生产的超纯去离子水(18.2 MΩ)。柴胡、黄芩、半夏(姜制)、党参、生姜、甘草和大枣购自四川省中药饮片有限公司,经四川省中医药科学院舒光明研究员鉴定。 2 方法和结果 2.1 柱温、流动相乙腈、磷酸质控 Symmetry ShieldTMRP18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5.0 μm);柱温30 ℃;流速0.45 mL·min-1;检测波长251 nm;流动相乙腈(A)- 0.01%磷酸(B),梯度洗脱,0～20 min,A-B(35∶65),20～60 min, 35%～65%A;进样量 10 μL,各对照品的平均理论塔板数均大于 3 000。 2.2 试验溶液和对照溶液的制备 2.2.1 乙醇制备社会主义新质醇 参考《中国药典》小柴胡汤颗粒的制备工艺,柴胡 360 g、黄芩 135 g、半夏(姜制)135 g 、党参 135 g、生姜 135 g、甘草 135 g 和大枣 135 g,以水煎煮 3 次,第 1 次加 10 倍量水,煎煮 2 h,第 2,3 次各加水 8 倍量水,煎煮 1 h,合并煎液,滤过,滤液过大孔吸附树脂柱,以70%乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,减压回收乙醇,浓缩干燥,备用。 2.2.2 标准储备液的配制 分别精密称取BCN,WGS,BCE,WGN和AG对照品适量,以甲醇配制成质量浓度分别为170,75,50 ,46 ,86 mg·L-1的混合对照品溶液,作为标准储备液。4 ℃ 冰箱冷藏保存。 2.3 峰面积积分回归 取混合标准储备液,用甲醇稀释成6个不同的浓度,按测定条件进样测定, 测定峰面积积分值,以紫外峰面积Y对浓度X进行线性回归。各对照品r均大于 0.999,线性关系良好。结果见表1。 2.4 色谱检测峰面积 取混合标准储备液,稀释10倍,进样10 μL,重复测定6次,记录色谱峰面积,BCN,WGS,BCE,WGN,AG 的RSD分别为1.9%,0.62%,0.85%,1.9%,0.08%。 2.5 供试品的测定 精密称取组成小柴胡汤的各药材,按照2.2.1项下方法制备供试品,取适量供试品甲醇溶解测定其中 BCN,WGS,BCE,WGN,AG 的含量。进行重复性考察,结果 BCN,WGS,BCE,WGN,AG 的 RSD 分别为 0.98%,0.49%,1.2%,2.4%,1.4%。 2.6 峰面积积分测定 取小柴胡汤提取物,用甲醇配制成供试品溶液,分别在1,3,24,48 h,进样10 μL,测定峰面积积分值。结果表明,供试品溶液在48 h内稳定,BCN,WGS,BCE,WGN,AG 的 RSD 分别为 2.5%,1.5%,0.92%,0.92%,1.1%。 2.7 有利于更好地发挥出理法的化合物 精密称取已知含量的小柴胡汤供试品适量(6 份),分别加入混合对照品溶液适量,超声 30 min。按含量测定方法测定,计算加样回收率,结