NY_T 544-2015猪流行性腹泻诊断技术.pdf

ICS 11.220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 544—2015代替NY/T544—2002猪流行性腹泻诊断技术Diagnostic techniques for porcine epidemic diarrhea2015-08-01实施2015-05-21 发布中华人民共和国农业部发布 NY/T544—2015前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准代替NY/T544—2002《猪流行性腹泻诊断技术》。本标准与NY/T544—2002相比，病原检测部分增加了RT-PCR检测方法。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，本标准主要起草人：冯力、陈建飞、时洪艳、张鑫。本标准的历次版本发布情况为：NY/T544—2002。I NY/T544—2015猪流行性腹泻诊断技术1范围本标准规定了猪流行性腹泻的病原学检测和血清学检测。病原学检测包括病毒分离与鉴定、直接免疫荧光法、双抗体夹心酶联免疫吸附试验和反转录一聚合酶链式反应。血清学检测包括血清中和试验和间接酶联免疫吸附试验。本标准适用于对猪流行性腹泻的诊断、产地检疫及流行病学调查等。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1猪流行性腹泻porcineepidemicdiarrhea，PED猪流行性腹泻是由尼多目（Nidoirales）、冠状病毒科（Coronaviridae）、α-冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的猪的一种高度接触传染性的肠道疾病，以呕吐、腹泻、脱水和哺育仔猪高死亡率为主要特征。4缩略语下列缩略语适用于本文件。CPE:cytopathic effect 细胞病变作用。DIA:direct immunofluorescence assay直接免疫荧光法。ELISA:enzyme-linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附试验PBS:phosphatebuffered saline磷酸盐缓冲液。PED:porcine epidemic diarrhea猪流行性腹泻。PEDV：porcineepidemicdiarrheavirus猪流行性腹泻病毒。RT-PCR:teverse transcription-polymerase chain reaction反转录一聚合酶链式反应。5临床诊断5.1流行特点本病一年四季均可发生，主要发生在每年的12月到翌年的3月，有时也发生于夏季、秋季。各种年龄的猪均可感染，尤其是1周龄内的哺乳仔猪，发病率和死亡率可高达100%。病猪、带毒猪和隐性感染猪是本病的主要传染源。病毒通过粪一口途径或感染母猪的乳汁进行传播。5.2临床症状病猪首先表现为呕吐，多发生在乳或吃食后，吐出的胃内容物呈黄色或乳白色。随后出现水样腹I NY/T 544—2015泻，腹泻物呈灰黄色、灰色，或呈透明水样，顺肛门流出，沾污臀部。表现脱水、眼窝下陷，行走，精神沉郁，食欲减退或停食。症状与年龄大小有关，年龄越小症状越重。1周龄以内的仔猪在发生腹泻3d～4d后，常因严重脱水而死亡。断乳猪、育肥猪以及母猪症状较哺乳仔猪轻，表现精神不振、厌食，持续腹泻4d～7d后逐渐恢复正常，少数猪生长发育不良。成年猪表现为厌食和腹泻，个别表现为呕吐。5.3病理变化肉眼可见的病理变化只限于小肠，可见小肠膨胀，肠壁变薄，外观明亮，肠管内有黄色或灰色液体或带有气体。肠系膜充血及肠系膜淋巴结肿大。组织学检查可见，小肠绒毛细胞的空泡形成和脱落，肠绒毛萎缩、变短，绒毛高度与隐窝深度从正常的7：1降低为3：1。超微结构的变化，主要发生在肠细胞的胞浆，可见细胞器的减少，产生电子半透明区，微绒毛终末网消失。细胞变得扁平。细胞脱落，进人肠腔。在结肠也可见到细胞变化，但未见到脱落。6实验室诊断6.1病毒分离与鉴定6.1.1仪器、材料与试剂除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的灭菌双蒸水或超纯水倒置显微镜、冷冻离心机、微孔滤器、细胞培养瓶、盖玻片、温箱等。Vero细胞系、仔猪空肠内容物及小肠内容物或粪便。磷酸盐缓冲液（PBS)、细胞培养液、病毒培养液、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸(HEPES)液（配制方法见附录A)。6.1.2病毒分离将采集的小段空