SN_T 3498-2013温泉鱼类志贺邻单胞菌病检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3498—2013温泉鱼类志贺邻单胞菌病检疫技术规范Quarantine protocol for Plesiomonas shigelloides from Garra rufa2013-03-01发布2013-09-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局香真药 SN/T 3498—2013前 創言本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国四川出人境检验检疫局、四川农业大学、中华人民共和国重庆出入境检验检疫局。本标准主要起草人：余华、杨光友、王昱、严玉宝、李应国、岳川、刘洋洋、陈世界、周岷江、胡娟崔鹏博。1 SN/T 3498—2013温泉鱼类志贺邻单胞菌病检疫技术规范1 范围本标准规定了温泉鱼类志贺邻单胞菌病的检疫技术规范。本标准适用于温泉鱼类志贺邻单胞菌病的临床诊断和分离鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用子本文件。GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法3临床诊断3. 1 临床症状鱼群出现厌食或不吃食；病鱼静止不动或阵发性乱游、乱窑，或在池边摩擦，最后衰竭而死；鱼体出现体色异常,呈现黑色;死鱼有较明显的出血症状3.2 病理变化病鱼鳍条基部及鱼体两侧轻度充血，体表侧线两侧出现自斑或溃疡斑，随着病情的加重，斑的颜色逐渐变深，严重病情时斑的颜色辜现黑色鳃盖胤围有出血点或出血斑鳃、肝、肾的颜色均较淡，呈现灰白色；肝脏出现出血点，胆囊肿大；腹腔内积有腹水，腹水呈淡黄色透明或红色浑浊；肠道出血或肠壁变透明，可见肠内容物。疫病的详细描述参见附录4　分离鉴定4. 1设备和器械4.1.1生物安全柜。4.1.2普通光学显微镜。4.1.37高压灭菌锅。4.1.4恒温培养箱(37℃士1℃）。4.1.5角解剖器械。4.1.6全自动生化鉴定系统。4.2培养基和试剂以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的二级水。4.2.1普通营养琼脂平板，制备见附录B的B.1。 SN/T 3498—20134.2.2　革兰氏染色液，配制见B.2～B.4。4.2.3SIM 培养基，配制见 B.5。4.2.4Kovacs 试剂,配制见 B.6。4.2.5市售触酶试剂。4.2.6市售氧化酶试剂。4.2.7*糖发酵试验管，配制见B.7。4.2.8/129诊断纸片，制作见B.8。4.2.9市售生化鉴定管（具体名称见附录C）。4.3类志贺邻单胞菌的分离和鉴定4.3.1样品采集挑选5～10尾濒死的或带有上述症状的温泉鱼，使用无菌水冲洗体表后，用75%的酒精棉球擦拭体表，无菌操作解剖发病温泉鱼，采用接种环从病鱼出血点或出血斑处、肝脏、脾脏和肾脏蘸取渗出物。4.3.2分离和纯化接种环划线接种到普通营养琼脂平板培养基，37℃恒温培养24h。挑取数个可疑单菌落，划线培养于普通营养琼脂平板上，37℃恒温纯化培养24h。类志贺邻单胞菌于普通营养琼脂平板的纯菌落生长良好，形成边缘整齐、表面湿润、中央隆起、光滑、半透明、灰白色至淡黄色的圆形菌落。4.3.3鉴定染色镜检挑取疑似菌落涂片到干净的玻璃载玻片，在酒精灯火焰上方固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗；滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；滴加95%乙醇脱色，约30s（或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s水洗；滴加沙黄复染液，复染1min；水洗，风干，镜检。志贺邻单胞菌为革兰氏阴性直杆菌，两端圆润，染色呈红色。初步生化试验.1氧化酶试验挑取少许单菌落涂抹于无菌的白色的滤纸片上，滴加1%盐酸四甲基对苯二胺（或商品化）氧化爵试剂于菌落之上，15 s～30s呈深紫色到暗绿色为阳性，否则为阴性。.2触酶试验挑取少许单菌落涂抹于干净的载玻片上，滴加2～3滴3%过氧乙酸（或商品化)触酶试剂，10s～20s出现大量气泡者为阳性，否则为阴性。.3运动性和吲哚试验取氧化酶、触酶阳性菌落穿刺接种 SIM培养基，37℃培养24 h，观察。细菌沿穿刺线向两侧扩增者为具运动性，否则为不具运动性；往管中加入数滴三氯甲烷（此时不要与火接触），2 min后再向管中加数滴Kovacs试剂，出现红色者为吲哚阳性，否则为阴性。.4糖发酵试验挑取吲哚阳性，有运动活性的可疑菌落少许。分别接种葡萄糖、麦芽糖发酵管（见B.7）。37℃培2 SN/T 3498—2013养 24 h。凡试验管颜色从紫色变为黄色，表明细菌可发酵该种糖类，则判为阳性。.50/129 敏感性试验挑取发酵葡萄糖、麦芽糖的可疑菌落接种营养肉汤，37℃培养 24 h。用