NYT 1471-2007牛毛滴虫病诊断技术.pdf

ICS 11.220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 1471—2007牛毛滴虫病诊断技术Diagnostic techniques for bovine Trichomoniasis2007-12-18 发布2008-03-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 1471-2007前言本标准的附录 A 为资料性附录。本标准由农业部市场与经济信息司（农业部质量办公室)提出。本标准由农业部畜牧兽医局质量标准办公室归口。本标准起草单位：南京农业大学动物医学院。本标准主要起草人：李祥瑞、徐立新、李春华、汪志楷、郑增忍。I NY/T 1471—2007引 言毛滴虫病是由胎儿三毛滴虫（Tritrichomonas foetus)寄生于牛生殖道引起的疾病。该病呈世界性分布，引起牛，尤其是奶牛生殖器官炎症、死胎、流产和不育，对畜牧业生产造成严重的经济损失。毛滴虫病被世界动物卫生组织列为 B类疾病。该病主要通过自然交配传播，以染病动物的精液和污染的器械人工授精也可引起传播。I NY/T 1471—2007牛毛滴虫病诊断技术1范围本标准适用于毛滴虫病的诊断。本标准规定了毛滴虫病的病原鉴定、聚合酶链反应(PCR)扩增虫体 DNA 的检测方法和结果判定标准。2原理2.1胎儿三毛滴虫可在显微镜下直接观察,也可经姬姆萨染色法染色后观察。2.2以胎儿三毛滴虫虫体 DNA 作模板,应用特异性的引物进行 PCR 反应,能扩增出特异性的条带。33主要材料和试剂3.1显微镜3.2载玻片3.3染色皿3.4姬姆萨(Giemsa)染色液3.5姬姆萨染色液稀释液3.6 PCR仪3.7离心机3. 8 PBS(pH7.2 0. 01 mol/L)3.9CTAB抽提液3. 10 CTAB/NaCI 溶液3.11高速离心机3.12涡旋振荡器3. 13 PCR 引物引物 TFR3(5-CGGGTCTTCCTATATGAGACAGAACC-3)引物 TFR4(5- CCTGCCGTTGGATCAGTTTCGTTAA- 3)3.14热启动 Taq 聚合酶3. 15 1×PCR 反应缓冲液3. 16 400 μM dNTPs3. 17 1. 5 mM MgCl3.18电泳仪3.19粉碎器,匀浆器,研钵和研杆,捣碎机3.20抗有机溶剂的试管或烧杯4检测步骤4.1 临床观察根据临床病史,母牛早期流产、多次复配不孕或发情不规则、阴道分泌物增加、子宫蓄脓，公牛包皮1 NY/T 1471—2007黏膜有结节、分泌大量脓性物和不愿交配等病史或症状和体征可做出初步诊断。4.2采样4.2.1母牛首先将母牛外生殖器洗涤干净，然后用 40 mL 以上的注射器,将 30 mL～40 mL 的30℃～35℃灭菌生理盐水急速注人阴道，以洗涤子宫和阴道壁，然后将洗涤液收集于离心管中，以1500 r/min～2000 r/min离心沉淀5min后，取沉淀物作为待检样品。也可取一长 30 cm、直径0.9cm,并在离一端9cm处弯成150度角的消毒玻璃管,注人少量的30～35℃灭菌生理盐水，收集母牛子宫颈黏液作为待检样品。收集待检样的适宜时间为发情过后几天。4.2.2公牛首先将公牛外生殖器洗涤十净，吸取5～10mL的30～35℃灭菌生理盐水注入包皮腔内,然后以手压紧包皮口，使液体在腔内滞留 3～5 min 后，再将洗涤液收集于离心管中，以1500r/min～2000r/min 离心沉淀5min后，取沉淀物作为样品。4.2.3精液取自人工采集或融化的冷冻精液适量，作为待检样品。4.2.4产仔牛、流产牛等可取胎盘液；流产胎牛可取胎儿第4胃的内容物；病牛可取子宫积脓排出物，以1500r/min～2000r/min离心沉淀5min后，取沉淀物作为待检样品。4.2.5样品采集后应立即镜检，若用于PCR检测可低温冷冻保存。注：不同情况下毛滴虫的数量有所不同,在流产胎儿、流产后几天和新近感染母牛子宫里均含有大量虫体。在感染后12～20天的母牛阴道黏液内也含有大量虫体,在一个发情周期内毛滴虫的数量也有所不同,发情后 3～7天内毛滴虫的数量最多。这些时段采集的样品可直接进行镜检。4.3虫体显微镜检查4.3.1压滴标本检查法将采集的待检样品1滴置于载玻片上，盖上盖玻片，在100倍或以上倍率的显微镜下，视野放暗，迅速进行检查。可重复进行2～3片。4.3.2染色标本检查法将采集的待检样品少量置于载玻片一端，立即推制成均匀的薄膜，在室温下干燥，后用甲醇固定2min,将固定的抹片浸入足量的姬姆萨染色稀释液的染色皿中,染色0.5～1小时,取出水洗，吸干或烘干,镜检。4.4PCR扩增虫体 DNA检查法4.4.1虫体DNA的制备将采集的样品与 PBS混合至总体积5.0 mL,在涡旋振荡器上混匀,取出 1mL移人 1.5mL微量离心管