饲料及饲料原料中呕吐毒素的快速筛查 胶体金快速定量法.docxVIP

饲料及饲料原料中呕吐毒素的快速筛查 胶体金快速定量法 范围 本标准规定了用胶体金免疫层析法快速筛查测定饲料及饲料原料中呕吐毒素，为定量筛查方法。 本标准适用于玉米、小麦、大米、黄豆、豆粕、花生粕、DDGS等原料中及以玉米粉，小麦粉为主要基质的饲料成品中呕吐毒素的快速定量筛查。定量检测限为0.5 mg/kg (ppm)，检测范围为0.5 mg/kg (ppm)—5.5 mg/kg (ppm)。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 20195 动物饲料 试样的制备 原理 本方法应用了免疫层析原理。将氯金酸用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒，标记针对呕吐毒素的单克隆抗体，用喷金法固定于硝酸纤维素（NC）膜上，同时，在硝酸纤维素（NC）膜的显色区域有两个条带：质控带和检测带，质控条带上包被有呕吐毒素抗原，检测条带上包被有抗呕吐毒素单克隆抗体的二抗。试样提取液中的呕吐毒素与检测条中胶体金微粒上的单克隆抗体发生反应，形成氯金酸-抗体-抗原聚合物，此聚合物和剩余的氯金酸-抗体聚合物在侧流作用下移动，当到达质控线时，质控条带上包被的抗原与剩余的氯金酸-抗体聚合物结合发生呈色反应，颜色深浅与试样中呕吐毒素含量负相关，而氯金酸-抗体-抗原聚合物继续在侧流作用下移动，到达检测条带后，与检测条带上的二抗形成氯金酸-抗体-抗原二抗的聚合物，此条带的颜色同试样中的呕吐毒素含量正相关。由于试样中的呕吐毒素的含量一定，质控带的颜色和检测带的颜色此消彼长，呈相关性。等试验反应平衡后，用读数仪扫描检测条上显色区域内检测条带和质控条带颜色深浅，根据颜色深浅和读数仪内置曲线计算出试样中呕吐毒素含量。 试剂和材料 除非另有说明，本法所用试剂均为分析纯，水为去离子水，符合 GB/T 6682 二级水的规定。 胶体金免疫层析快速筛查组件（参见附录A）。 呕吐毒素残留检测试纸条。 样本提取液。0.1% 的Triton X-100水溶液：量取1L实验用溶液，加入1g Triton X-100 ，混匀。商品试剂盒中提供此溶液。 氢氧化钠（NaOH 1 mol/L）：称取40g氢氧化钠，加水定容至1000ml，混匀。 盐酸（HCL，1 mol/L）：量取83.33 mL ρ = 1.18 g/mL的盐酸，加水定容至1000 mL，混匀。 仪器和设备 天平：感量0.01 g。 涡旋仪。 离心机：转速≥3000 r/min。 微量移液器：20 μL～200 μL。 聚苯乙烯离心管：50 mL。 读数仪：可测定并显示胶体金定量检测条的测定结果。 试样制备与保存 试样制备 按GB/T 20195要求制备试样。 试样保存 将试样于-10℃～-20℃下避光保存。 分析步骤 试样提取 称取(1.00±0.01) g饲料样品至50 mL聚苯乙烯离心管中，加入15 mL 样品提取缓冲液（2.1.3），将瓶塞盖紧，涡动3 min，室温3000 r/min以上离心5 min，取100 μL上清液待测。 非谷物基质，如果上清液 pH 值小于6或大于8，则需要用 1 mol/L 氢氧化钠溶液（4.2）或 1 mol/L 盐酸溶液（4.3）调节 pH 至7左右，然后取 100μL 此溶液加入 600 μL 样本稀释液（4.1.2），混匀，待测 不同厂家的呕吐毒素胶体金快速定量条所用的样品制备方法不同，如提供呕吐毒素胶体金快速定量检测条使用说明，则按照使用说明中规定的方法进行操作。 试样筛查 将胶体金检测条（4.1.1）从冷藏状态（2℃-8℃）取出放置至最适试验温度（23℃-25℃）。将读数仪（5.6）打开，按照提示输入样品，检测人员，检测项目，方法等相关信息。将比色卡平放于桌面，用读数仪扫描比色卡上的二维码，等待检测。 准确移取100μL待测溶液（7.1），加入检测条加样孔中，准确计时5分钟。 孵育5min后，用读数仪扫描检测卡，按下读取键，几秒钟读数仪的屏幕上即可显示测试样中呕吐毒素的含量信息。可选择打印，传输，储存此信息。 如结果显示：invalid ,如果检测条上质控线（C线）无色，测试线（T线）上颜色肉眼可见很深，则表明试样中呕吐毒素含量非常高，可将试样提高稀释倍数，重新进行检测。 结果表述 呕吐毒素含量以ppm（mg/kg毫克每千克）表示，由读数仪直接显示和读取。 重复性 在同一实验室，由同一操作者使用相同仪器，按相同的测定方法，并在短时间内对同一被测试对象相互独立进行测试获得的两次独立测试结果的绝对差值大于算术平均值20%的情况不超过5%。 （资料性附录）胶体金免疫层析快速筛查组件试剂配制与