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[pcr技术]PCR技术原理 篇一 : PCR技术原理 扩展:pcr技术原理是什么 / pcr是什么意思 / pcr技术原 理及步骤 扩展:pcr技术原理是什么 / pcr是什么意思 / pcr技术原理及 步骤 篇二 : PCR技术原理 变性与复性 DNA的变性: 在某些理化因素作用下，DNA 分子内碱基对之间的氢键断裂，使 规则有序的双螺旋结构变为不规则 无序的单链线团样结构的过程。 解链温度 : 使50%的DNA发生变性时的环 境温度。 DNA的变性从开始解链到完全 解链是在一个相当窄的温度内完成 的。 增色效应: DNA变性后对 260nm紫外光收 增加的现象。 DNA的复性+2 ? 20bp Tm=69.3+0.41% ? Tm=81.5?+16.6lgM+0.41% -500/n-0.61× PCR技术总论 聚合酶链反应简称 ,,,，是一项在短时间内大量扩增特定的,,, 片段的分子生物学技术。 东胜创新 聚合酶链式反应也可以当作一项极其重要的酶促合成 DNA技术。PCR又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体 外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新，它 可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。 70年代初，Kleppe等人就提出了PCR的工作原理。Saiki 和Mullis两家研究室分别用改进的Kleppe 法获得了大量染色体DNA单拷贝基因。当时的PCR技术须在 每次变性和退火后，扩增反应前重新加入DNA聚合酶。1988 年，由于在PCR系统引入了热稳定的TaqDNA聚合酶，这是从 水生栖热菌中提取的耐热DNA聚合酶， 简称Taq DNA聚合酶。多次循环后的Taq DNA聚合酶仍然具 有活性，因此反应体系自动往复多次地进行对所需的DNA的 片段的酶促合成，使反应产物按指数增长，所以命名为聚合酶 链式反应。 东胜创新 PCR基本原理 PCR是一种选择性 体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤: 变性 :目的双链DNA片段在94?下解链; 退火:两种 寡核苷酸引物在适当温度下与模板上的目的序列通过氢键 配对; 延伸: DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶 的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保 留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重 复 循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的―半保留复制链‖，而 且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2,4分钟， 2,3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。。 到达 平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 。 东胜创新 PCR原理 Sample denaturatation Primer annealing Primer extension PCR product PCR反应曲线 标准的PCR反应体系 ? 10×扩增缓冲液 4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合 酶 Mg2+ 加双或三蒸水至 10ul 各200umol/L 10,100pmol 0.1,2ug 2.5u 1.5mmol/L 100ul PCR反应五要素 ? 引物 ? 酶 ? dNTP ? 模板 ? Mg2+ 引物 ? 引物是PCR特异性反应的关键 ? PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA互补的程度 ? 理论上，只要知道任何一段模板DNA序 列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做 引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大 量扩增 引物设计的原则 ?引物长度: 15-30bp，常用为20mer左右 – 引物的有效长度不能大于 38 mer，否则最适延伸 温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度， 不能保证PCR扩增产物的特异性 ?引物扩增跨度:以500bp为宜 – 特定条件下可扩增长至10kb的片段 ?引物碱基:G+C含量以40-60%为宜 – G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异 条带 – ATGC 最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列 引物设计的原则 ?避免引物内部出现二级结构 – 避免两条引物间互补， 特别是 3’端的互补，否 则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带 ?引物 3’端的碱基要求严格配对 – 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端 碱基不配对而导致PCR失败 ?引物中有或能加上合适的酶切位点 – 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶 切分析或分子克隆很有好处 引物设计的原则 ?引物的特异性: – 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同 源性 ?引物量: – 每条引物的浓度0.1 ~ 1umol或10 ~ 100 pmol， 以最低引物量产生所