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三聚氰胺致大鼠肾毒性的机制及病变特点 三聚氰胺是一种白色的倾斜晶，略微溶于水。大鼠的ld50为3.16g/kg，属于低毒物质。目前研究认为同时给予三聚氰胺和三聚氰酸喂饲动物可在肾脏形成晶体并导致急性肾衰竭。本课题之前已对有关三聚氰胺致大鼠肾损伤模型进行了研究。已证实单独给予三聚氰胺亦可在肾脏形成晶体致大鼠肾衰竭。但对于晶体在体内形成的过程及导致肾衰机制不明确。本研究旨在探讨三聚氰胺致大鼠肾损伤发生机制。 1 材料和方法 1.1 大鼠的分组和毒种 4周龄清洁级Wistar大鼠,体重(80±10)g,由吉林大学实验动物中心提供,许可证号:SCXK(吉)2003-0001。将大鼠随机分为染毒组和对照组,每组20只,雌雄各半。屏障环境饲养,动物房许可证号:SYXK(黑)2006-008[(温度(24±2)℃,湿度(45±10)%]。 1.2 实验仪器和试剂 日立7080型全自动生化分析仪,TSQ Quantum Discovery MAX(Thermo公司),X’Pert Pro型X射线衍射仪(帕纳科公司)。掺入饲料的三聚氰胺为化学纯(含量≥99%,国药集团化学试剂有限公司)。液相色谱-质谱分析用三聚氰胺、三聚氰酸对照品由中国计量科学研究院提供。 1.3 方法 1.3.1 小鼠肝肾组织病理学检查 饲料中三聚氰氨含量为250 mg/kg,摄食量以10%体重计算,三聚氰胺染毒组每日染毒剂量为25 mg/kg。对照组喂饲相同饲料但不加三聚氰胺。动物染毒第21天用代谢笼收集尿液,记录24 h尿量。4周后取血清进行生化检测,剖检动物肾脏进行大体观察;徒手切片,解剖镜下观察形态学改变。以甲醛固定肾脏,常规制片,HE染色,进行组织病理学检查。称重肾脏,计算肾/体比值。 1.3.2 三聚氰胺和三聚氰酸的定量检测 取肾脏,加蒸馏水,制备匀浆,加乙腈超声提取,以液相色谱-质谱联用检测三聚氰胺、三聚氰酸含量。 1.3.3 匀浆、干燥 分别取三聚氰胺染毒组及对照组肾脏,制备匀浆,离心,干燥;分别配制三聚氰胺和三聚氰酸溶液,混合后瞬间混浊,离心,干燥,得到体外合成的三聚氰胺-三聚氰酸晶体。 1.3.3. 2x射线衍射仪的检测 1.4 统计分析 采用STATA 8.0软件进行统计分析。数据以表示。根据数据的正态性和方差齐性,选择单因素方差分析比较两组间差别。 2 结果 2.1 两组体重、肾/体比值比较 喂饲含三聚氰胺饲料3周左右,动物出现食欲下降,体重增长缓慢,少动,多尿。体重增长低于对照组,差异有统计学意义(P0.01);肾脏绝对重量和肾/体比值均显著增加,与对照组比较,有统计学意义(P0.01)。第21天24 h尿量与对照组比较,显著增多,有统计学意义(P0.01),见表1。 2.2 组三酯水平比较 三聚氰胺染毒组血清尿素氮、肌酐和甘油三酯水平显著升高,与对照组比较,有统计学意义(P0.01)。雄鼠高于雌鼠,有统计学意义(P0.01),见表2。 2.3 两组患者的血压比较见表1 肉眼可见双肾脏明显肿胀增大,呈土黄色沙石样外观(封三图1),与对照组明显不同。于解剖镜下观察新鲜肾脏冠状切面约0.5 mm切片,可见肾皮质、髓质弥漫分布的点片状阴影(封三图2A),与对照组比较明显不同(封三图2B)。 2.4 肾组织中皮细胞的破碎或形态扩张 三聚氰胺组肾组织镜下可见直径不等的圆形晶体,间质纤维增生,间质细胞增多(封三图3A)。结晶体单独或积聚或呈扇形、楔形不规则碎片出现于肾小管中(封三图3B)。并可见高度扩张的肾小管中的晶体周围伴有坏死脱落的小管上皮细胞碎片及炎细胞(封三图3C)。对照组肾小管上皮完整,管腔内未见晶体及炎细胞(封三图3D)。 2.5 三聚氰胺-三聚氰酸水溶液的质量分析和定量检测 肾组织三聚氰胺含量为82μg/g(图4A),三聚氰酸的含量为69μg/g(图4B)。 2.6 显微镜下外晶体合成的结果 体外合成的三聚氰胺-三聚氰酸晶体为针状晶体(封三图5)。 2.7 x射线检测法 对照组样品为典型的非晶态结构,X射线衍射角在12°~32°之间有一宽的漫散峰,三聚氰胺组样品在相同的位置也存在着漫散峰。三聚氰胺组样品和体外合成的样品三强峰的位置基本吻合,故经X射线检测可初步判定,体内形成的晶体与体外合成的晶体结构相同。由此可确定,三聚氰胺组动物肾脏中的晶体为三聚氰胺-三聚氰酸结合晶体(封三图6)。 3 聚氰胺和三聚氰酸对肝肾的影响 本研究给予大鼠喂饲含有250 mg/kg三聚氰胺的饲料后,大鼠出现食量减少,体重增长缓慢、少动、多尿等异常表现,血清尿素氮、肌酐和甘油三酯等生化指标异常增高,表明动物出现肾功能衰竭。剖检肾脏,肉眼观察发生明显病变。解剖镜下肾组织中可见弥漫性分布的点片状阴影,经组织病理学检查及液相色谱-质谱检测,证实其为存在于肾小管、肾盏和肾盂中的三