荧光定量技术与常见问题分析详解演示文稿.pptVIP

定量PCR的数学原理 当前第63页\共有106页\编于星期日\14点 怎样获得结果 首先让我们定义扩增曲线的各种参数。 当前第64页\共有106页\编于星期日\14点 PCR的动力学曲线和四个阶段 当前第65页\共有106页\编于星期日\14点 指数扩增期 重复性 准确性 动态范围 3个阶段中 最佳时期 当前第66页\共有106页\编于星期日\14点 只有一个扩增期提供高质量的数据 指数扩增期 当前第67页\共有106页\编于星期日\14点 基 线 基线（空白）信号的产生是由于背景引起的 当前第68页\共有106页\编于星期日\14点 阈 值 默认阈值=基线（背景）信号标准偏差x10 当前第69页\共有106页\编于星期日\14点 怎么获得结果 第一步：确定Ct值 当前第70页\共有106页\编于星期日\14点 怎么获得结果 第二步：比较Ct值 当前第71页\共有106页\编于星期日\14点 定量PCR的应用 绝对定量 相对定量 阴阳性鉴定 基因分型 当前第72页\共有106页\编于星期日\14点 定量PCR实验设计和流程---绝对定量和相对定量 当前第73页\共有106页\编于星期日\14点 定量PCR的实验要素 目的基因 样品 标准曲线 标准品 监控系统故障 阳性对照 监控污染 阴性对照 校准生物学误差 内参(管家基因) 校准物理误差 参比荧光 降低随机误差 重复实验 当前第74页\共有106页\编于星期日\14点 相对定量实验 示例实验 未处理样本 处理后样本 目的基因：Plat1 实验目的：样本处理后，Plat1基因的表达量有什么变化？ 当前第75页\共有106页\编于星期日\14点 实验流程 对照样本 当前第76页\共有106页\编于星期日\14点 两种相对定量的方法 比较Ct（ΔΔCt）法 相对标准曲线法 样本间目的基因的倍数关系 当前第77页\共有106页\编于星期日\14点 两种方法的区别 比较Ct (ΔΔCt) 法 相对标准曲线法 * 已知各个基因的扩增效率 * 每个基因都要做一条标准曲线 * 不需要每次都做标准曲线 * 准确的扩增效率计算 * 简单, 经济, 通量较高 * 工作量大, 成本高, 通量较低 当前第78页\共有106页\编于星期日\14点 如何选择相对定量的方法 当前第79页\共有106页\编于星期日\14点 如何选择相对定量的方法 当前第80页\共有106页\编于星期日\14点 如何选择相对定量的方法 在EXCEL中制作图表 当前第81页\共有106页\编于星期日\14点 如何选择相对定量的方法 在EXCEL中制作图表 斜率0.1 斜率0.1 比较Ct (ΔΔCt) 法 相对标准曲线法 当前第82页\共有106页\编于星期日\14点 ΔΔCt法 必要条件： 目的基因和内参基因必须有相一致的扩增效率，并尽可能接近100%。 当前第83页\共有106页\编于星期日\14点 ΔΔCt法 如何确认扩增效率接近100%？ 每条引物一条标准曲线 当前第84页\共有106页\编于星期日\14点 ΔΔCt法 标准曲线可以帮助判定扩增效率 例如：斜率-3.3说明扩增效率接近100%； 更小的负值（如-3.5）说明扩增效率小于100% 公式：E=10 (-1/斜率) -1 当前第85页\共有106页\编于星期日\14点 ΔΔCt法结果计算 步骤一：内参基因均一化样本差异 Ct目的基因 - Ct目的基因 = ΔCt 步骤二：处理样本和对照样本作比较 ΔCt处理样本 - ΔCt对照样本 = ΔΔCt 步骤三：使用公式计算 倍数变化 = 2 -ΔΔCt 当前第86页\共有106页\编于星期日\14点 公式含义 2 -ΔΔCt 2 = 循环间扩增产物量的变化（PCR扩增产物倍增） ΔΔCt =处理样本和对照样本之间校正过大循环数的变化 所以，这个公式告诉我们对照样本和处理样本之间目的基因的倍数变化。 当前第87页\共有106页\编于星期日\14点 ΔΔCt法计算示例 当前第88页\共有106页\编于星期日\14点 ΔΔCt法计算示例 为了去除样本间加样量不同带来的误差，需要对数据均一化处理。 当前第89页\共有10