1RNAseq质量控制分析和总结.docx

. . Word Word 文档 RNA-seq 质量控制 建库流程 Total RNA 样品检测 琼脂糖凝胶电泳分析 RNA 降解程度以及是否有污染 一句话总结：琼脂检测主要观察 28s 和 18s。判断 RNA 好坏的标准是２8s，18s 是否清晰，尤其是 28S 亮度比 18s 亮度大 28s，主要是剪切前的前体 RNA，主要包括不均一核 RNA（未剪切成熟的 mRNA 前体）和主要是 28s，18s,5s 的前体转录子。前体存在于细胞核（然后加工剪切成28s，18s，5s 和成熟的小片段的 mRNA。这些成熟的RNA 进入到胞浆。有功能的 mRNA 是存在于胞浆中的成熟的 mRNA，前体 mRNA 是没有翻译功能的（蛋白质翻译机器，核单倍体是位于胞浆中的）。真正成熟的 mRNA，主要集中在 28s 和 18s 之间的荧光背景（一般每条基因 mRNA 量很少，所以，整体一般看不到明显带）.如果 28s 只是比 18s 稍高，或者亮度差不多， 即使条带清晰，也已经提示部分降解了。大片段开始降解，从 28s 降解到 18s 最后降解到 5s。这样降解过程中，28s 减少，18s 增多，28s：18s 比例就会下降。如果最容易降解的 28s 都没有降解，（从比例推断），那么更难降解的 mRNA，就推理出肯定是完好的了。 泳道： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 这图片就是一个离心柱子提取 RNA 的不同降解情况的典型例子。 泳道 1,5,6,7,8,9 部分降解了，所以 28s 是首先降解，28s 条带变淡，而部分降解首先是降解成较小的 18s 左右的片段，所以 18s 条带明显变粗，造成28s：18s 的比例竟然小于 1 了。然后在不该看到条带或者应该是很弱的 5s 位置，出现了较明显的 5s 大小的降解带。 3,4 是完全降解了，28s，18s 已经基本降解光了。两条带都看不见了。最后降解成的小片段正好和 5s 大小一致，所以在 5s 位置看到了大量的一条浓浓的降解小片段，和 5s 一样大小。 就是完全正常提取的 RNA，大家可以看到 28s:18s 比例大约是 2:1,5s 位置也基本见不到带。这就说明完全正常，无降解。 Nanodrop 检测 RNA 的纯度（OD260/280 比值） 一句话总结：260/280 大约在 2.0 而 260/230 ration 在 2.0-2.2. 一句话总结：260/280 大约在 2.0 而 260/230 ration 在 2.0-2.2. OD260 代表核酸的吸光度，OD280 代表蛋白质的吸光度。280、320、230、260nm 下的吸光度分别代表了 核酸、背景（溶液浑浊度 核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。A230 测定其它碳源物质，如酚，糖类等；A260 是核酸的吸收峰测 RNA 和 DNA，引物等的浓度用的；A280 是蛋白质的吸收峰。 一般的，我们只看 OD260/OD280（Ratio，R）——1.8~2.0 时，我们认为 RNA 中蛋白或者时其他有机物 的污染是可以容忍的，不过要注意，当用 Tris 作为缓冲液检测吸光度时，R 值可能会大于 2（一般应该是 的污染是可以容忍的，不过要注意，当用 Tris 作为缓冲液检测吸光度时，R 值可能会大于 2（一般应该是 2.2 的）。当 R1.8 时，溶液中蛋白或者其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定这份 RNA 的命运。当 R2.2 时，说明 RNA 已经水解成单核酸了。 纯 RNA 的 A260/A280 的比值为 2.0。 的命运。当 R2.2 时，说明 RNA 已经水解成单核酸了。 纯 RNA 的 A260/A280 的比值为 2.0。 OD260/OD230 的比值还表明 RNA 的纯度——其值 2.0 表明裂解液中有亚硫氰胍和β-巰基乙醇残留，其值 2.4，需用乙酸盐，乙醇沉淀 RNA。 Qubit 对 RNA 浓度进行精确定量 一句话总结：RNA-seq 测序需要至少 300 ng 总 RNA Agilent 2100 精确检测 RNA 的完整性 一句话总结：2100 RIN 值高好，样品间 RIN 值相差 1-1.5 最好。 Agilent 2100 对文库的 insert size 进行检测，RIN 值反应的是样品的降解。RIN=RNA integrity number，即RNA 分子完整数，从 0-10，直接反应了 RNA 质量的好坏，此数值越大表明 RNA 质量越好越完整。 建库流程 ssRNA-seq 建库（针对长非编码 RNA 分析） RNA 检测合格后，通过 epicentre Ribo-ZeroTM试剂盒去除 rRNA（可以拿到非 polyA 的转录本）