酶工程酶和细胞的固定化演示文稿.pptVIP

4.3 固定化酶的性质 当前第62页\共有78页\编于星期一\15点 举例：含-COOH载体, 如CMC 酶中游离氨基 参与反应 与琥珀酰亚胺反应 与氯化亚砜反应 当前第30页\共有78页\编于星期一\15点 举例：含-COOH载体, 如CMC 与酶中游离氨基、巯基、羟基、酚羟基反应 叠氮化反应 酯化 酰肼衍生物 叠氮衍生物 当前第31页\共有78页\编于星期一\15点 举例：含-OH载体, 如多糖 与酶中游离氨基、羟基反应 与溴化氰反应 活泼的 亚胺碳酸酯 条件 温和 当前第32页\共有78页\编于星期一\15点 举例：含-OH载体, 如多糖 与酶中游离氨基、羟基、巯基反应 与三氯均三嗪反应 磺酰化反应 环氧化反应，如Eupergit? 当前第33页\共有78页\编于星期一\15点 举例：含硅无机载体 方法一：载体表面包覆有机层（如琼脂糖、葡聚糖、白蛋白），或用表面聚合法“镀上”一层聚合物，再对包覆后的表面活化 方法二：利用有机硅试剂直接活化硅羟基 当前第34页\共有78页\编于星期一\15点 蒸馏水 1mL , 1mol/L HCl 1mL， 5% NaNO2 1mL ABSE-交联琼脂 3g 冰水浴，15min，洗去NO2- 4℃备用 1mol/L Na2CO3调节pH 7.0，冰水浴2h ABSE-交联琼脂固定化碱性磷酸酯酶 碱性磷酸酯酶约300u，BSA 20mg，NaCl，MgSO4，ZnSO4溶液 重氮盐 ABSE：对氨基苯磺酰乙基 当前第35页\共有78页\编于星期一\15点 (3) 包埋法 不涉及化学修饰，条件 温和，酶活力回收率高 凝胶包埋法： 酶分子包在高聚物格子中 当前第36页\共有78页\编于星期一\15点 i. 天然凝胶包埋法 海藻酸钠 +细胞+酶 CaCl2溶液 其他天然凝胶： 明胶、 琼脂凝胶、 卡拉胶等 当前第37页\共有78页\编于星期一\15点 喷射切割器 当前第38页\共有78页\编于星期一\15点 注射方法得藻酸盐球珠 喷射切割器 得藻酸盐球珠 当前第39页\共有78页\编于星期一\15点 ii. 聚丙烯酰胺凝胶包埋法 聚丙烯酰胺凝胶的合成与酶的包埋 —— 网格型 丙烯酰胺 BIS BIS：N,N’-亚甲基双丙烯酰胺 当前第40页\共有78页\编于星期一\15点 1. 酶 2. 单体 + 交联剂 3. 起始剂 4. 搅拌分散 1. 酵母乳糖酶（100mg）溶于56mL磷酸缓冲液（pH7.3） 2. 丙烯酰胺单体 15~30% BIS交联剂5% 3. 起始剂：0.6mL TEMED，200mg过硫酸铵缓冲液 4. 1mL 失水山梨醇半油酸酯，400mL甲苯-氯仿 固定化酶颗粒 100~200μm 珠状聚丙烯酰胺包埋β-半乳糖苷酶 ii. 聚丙烯酰胺凝胶包埋法 氮气， 4℃，30min BIS：N,N’-亚甲基双丙烯酰胺； TEMED：四甲基乙二胺 搅拌分散 当前第41页\共有78页\编于星期一\15点 1. 酶 2. 单体 + 交联剂 3. 起始剂 1. 1kg 湿重E. coli悬浮于2L 0.9%NaCl，8℃ 2. 丙烯酰胺单体 750g，BIS交联剂2.4L，8℃ 聚丙烯酰胺包埋大肠杆菌（天冬氨酸酶） 3. 100mL β-二甲基氨基丙腈，500mL，1% 过硫酸钾（起始剂）20~25℃ 到30℃时冰水 迅速冷却 凝胶切成3~4mm3的立方体 ii. 聚丙烯酰胺凝胶包埋法 15~20min 当前第42页\共有78页\编于星期一\15点 来自小牛肠黏膜的纯碱性磷酸酶（ALP）被四甲氧基 硅烷（TMOS）溶胶-凝胶固定化后活力回收30%， 与溶液酶相比，稳定性提高。 iii. 溶胶-凝胶包埋法 将无机硅源前驱体与酶混合，水解、缩合反应，得透明溶胶，经陈化、聚合形成多孔凝胶，即得固定化酶 当前第43页\共有78页\编于星期一\15点 B. 微囊化：以物理方式将酶包封于半透膜内 微囊内径几微米-几百微米，酶关在不同构型半透膜外壳内，小分子自由进出，避免酶失活。 酶被胶囊膜限制在内部，底物或产物可以自由扩散。 微胶囊材料：聚酰胺膜、火棉胶膜等 当前第44页\共有78页\编于星期一\15点 界面沉淀法制备微胶囊 乳化 油包水 的微滴 加入高聚物 高聚物在油水界 面上沉淀、析出， 将酶包埋 当前第45页\共有78页\编于星期一\15点 微胶囊制备方法 界面沉淀法：某些聚合物在油水界面上溶解度降低而形成的薄膜将酶包埋。 界面聚合法：亲水性单体 + 疏水性单体在界面发生聚合将酶包埋。 二级乳化法：酶先在聚合物相中分散乳化，再分散于水中形成次级乳化液，而后将聚合物溶液固化。 脂质体包埋法：类似于“细胞质膜”式的结构。 聚电解质络合法：如海藻酸钠与聚赖氨酸通过静电作用结合。