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药物靶标鉴定的思路与方法 Small molecules Target proteins Drug discovery and development Cancer Res, 2013 PNAS, 2016 Nature Chemical Biology, 2018 Trends Biochem Sci, 2018 Trends Pharmacol Sci. 2018 Pharmacology Therapeutics, 2018 药物靶标-What 药物靶标-Why 鉴定药物靶标-How 药物靶标蛋白-Definition 药物靶标-What? Protein DNA RNA 药物靶标-Why? 1. 阐明药物作用分子机制 --- 关联性 --- 因果性 2. 药物开发 --- 结构优化 --- 高效低毒 3. 高水平研究论文 药物靶标-Polypharmacology One drug one target One drug multiple targets Nat Chem Biol. 2008;4(11):682-90. 鉴定药物靶标-How? 鉴定药物 直接结合蛋白 药物表型的 筛选/发现/鉴定 Profile binding protein- pulldown assay Label-based vs Label free Exogenous vs Endogenous Non-specific vs Specific (N.C) Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) 1.无需标记药物 2.无差别发现直接结合蛋白 3.基于内源表达蛋白 Brett L, et al, PNAS, 2009 DARTS/2D-DIGE/Mass Spectrometry Yi Qu, et al, PNAS, 2016 DMSO Axitinib DMSO / Axitinib TSA ITC MST X-Ray NMR SPR Validation of Direct binding Proteins X射线晶体法 （X-ray?crystallography）? 利用电子对X射线的散射作用，X射线晶体学可以获得晶体中电子密度的分布情况，再从中分析获得原子的位置信息，即晶体结构 核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR） 原子核的核磁共振信号频率位置与所处的微观结构有关，提供分子结构信息 可以对溶液（非晶态）和不能结晶或结晶后构象会改变的蛋白质进行检 是X-ray以外最主要的蛋白质结构测定方法之一 表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance,SPR） 利用表面等离子共振的物理光现象，非标 生物分子间结合特异性的分析、结合动力学和亲和力分析以及热力学分析 等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry，ITC） 在绝热条件下，用一种反应物滴定另一种反应物，测量两者的化学或物理作用引起体系温度的变化 原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息，没有任何限制条件 蛋白热转移实验 （thermal shifting assay， TSA） 在温度上升过程中，蛋白质构象逐渐发生改变，变性后暴露出的疏水基团可以被检测出来 可以用于高通量筛选 Very few cancer drivers have been drugged Rita Santos, Nature Reviews of Drug discovery,2017 What is the problems? Endogenous vs Purified protein --- Over 400 kinds of PTM --- Extensive protein-protein interactions --- Purification of full-length proteins --- Structural data are not available MicroScale Thermophoresis (MST) MicroScale Thermophoresis (MST) Label-free ------Any small molecule ------No b