蛋白质的沉淀和变性实验.doc

蛋白质的沉淀与变性反应 目的 (1)了解蛋白质的沉淀反应、变性作用和凝固作用的原理及它们的相互关系。 (2)学习盐析和透析等生物化学的操作技术。 原理 在水溶液中，蛋白质分子的表面，由于形成水化层和双电层而成为稳定 的胶体颗粒，所以蛋白质溶液和其他亲水胶体溶液相类似。但是，蛋白质胶 体颗粒的稳定性是有条件的，相对的。在一定的物理化学因素影响下，蛋白 质颗粒失去电荷，脱水，甚至变性，则以固态形式从溶液中析出，这个过程 称为蛋白质的沉淀反应。这种反应可分为以下两种类型: 一、可逆淀汲反应 在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但它的分子内部结构并未发 生显著变化，基本上保持原有的性质，沉淀因素除去后，能再溶于原来的溶 剂中。这种作用称为可逆沉淀反应，又叫作不变性沉淀反应。属于这一类的 反应有盐析作用; 在低温下，乙醇、丙酮对蛋白质的短时间作用以及利用等 电点的沉淀等。 二、不可逆沉淀反应 在发生沉淀反应时，蛋白质分子内部结构、空间构象遭到破坏，失去原 来的天然性质，这时蛋白质已发生变性。这种变性蛋白质的沉淀不能再溶解 于原来溶剂中的作用叫作不可逆沉淀反应。重金属盐、植物碱试剂、过酸、 过碱、加热、震荡、超声波，有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。 试剂和器材 一、试剂 1．蛋白质溶液 取5m1鸡蛋蛋白蛋清，用蒸馏水稀释至100ml，搅拌均匀后用4-8层纱 布过滤，新鲜配制。 2．蛋白质氯化钠溶液 取20ml蛋清，加蒸馏水200ml和饱和氯化钠溶液100ml，充分搅匀 后，以纱布滤去不溶物(加入氯化钠的目的是溶解球蛋白)。 硫酸铵粉末，饱和硫酸铵溶液，3%硝酸银，0.5% 醋酸铅，10% 三氯醋 酸，浓盐酸，浓硫酸，浓硝酸，5% 磺基水杨酸(sulfosalicyclic acid)，0.1% 硫酸铜，饱和硫酸铜溶液，0.1% 醋酸，10% 醋酸，饱和氯化钠溶液，10% 氢氧化钠溶液。 二、器材 试管，试管架，小玻璃漏斗，滤纸，玻璃纸，玻璃棒，500ml 烧杯，10 ml量筒。 操作方法 一、蛋白质的可逆沉淀反应 蛋白质的盐析作用 用大量中性盐使蛋白质从溶液中沉淀析出的过程称为蛋白质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子被盐脱去水化层，同时蛋白质分子所带的电荷被中和，结果蛋白质的胶体稳定性遭受破坏而沉淀析出。析出的蛋白质仍保持其天然蛋白质的性质。减低盐的浓度时，还能溶解。 沉淀不同的蛋白质所需中性盐的浓度不同，而盐类不同也有差异。例如:向含有白蛋白和球蛋白的鸡蛋清溶液中加硫酸镁或氯化钠至饱和，则球蛋白沉淀析出。加硫酸钱至饱和，则白蛋白沉淀析出。另外，在等电点时，白蛋白可被饱和硫酸镁或氯化钠或半饱和的硫酸铵溶液沉淀析出。所以在不同条件下，用不同浓度的盐类可将各种蛋白质从混合溶液中分别沉淀析出，该法称为蛋白质的分级盐析。目前在腌的生产和制备、科学研究工作和临床化验等工作中广泛应用。 取一支试管加入3m1蛋白质氯化钠溶液和3m1饱和硫酸铵溶液，混匀，静置约10 min，球蛋白则沉淀析出，过滤后向滤液中加入硫酸铵粉末，边加边用玻璃棒搅拌，直至粉末不再溶解，达到饱和为止。析出的沉淀为白蛋白。静置，倒去上部清液，白蛋白沉淀，取出部分加水稀释，观察它是否溶解，留存部分作透析用。 二、蛋白质的不可逆沉激反应 1．重金属沉淀蛋白质 重金属盐类易与蛋白质结合成稳定的沉淀而析出。蛋白质在水溶液中是酸碱两性电解质，在碱性溶液中(对蛋白质的等电点而言)，蛋白质分子带负电荷，能与带正电荷的金属离子结合成蛋白质盐。在有机体内，蛋白质常以其可溶性的钠盐或钾盐的形式存在，当加入汞，铅、铜、银等重金属盐时，则蛋白质形成不溶性的盐类而沉淀。经过这种处理后的蛋白质沉淀不再溶解于水中，说明它已发生了变性。重金属盐类沉淀蛋白质的反应通常很完全，特别是在碱金属盐类存在时。因此，生化分析中，常用重金属盐除去体液中的蛋白质;临床上用蛋白质解除重金属盐的食物性中毒。但应注意，使用醋酸铅或硫酸铜沉淀蛋白质时，试剂不可加过量，否则可使沉淀出的蛋白质重新溶解。 取2支试管，各加入约1m1蛋白质溶液，分别加入3 % 硝酸银3-4滴，0.5% 醋酸铅1-3滴和0.1%硫酸铜3-4滴，观察沉淀的生成。第一、二支试管再分别加入过量的醋酸铅和饱和硫酸铜溶液，观察沉淀的再溶解。 2．有机酸沉淀蛋白质 有机酸能使蛋白质沉淀。三氯醋酸和磺基水杨酸最有效，能将血清等生物体液中的蛋白质完全除去，因此得到广泛使用。 取两支试管，各加入蛋白质溶液约0.5 m1，然后分别滴加10% 三氯醋酸和5%磺基水杨酸溶液各