DNA测序技术及其应用-PPT课件.ppt

光影成像DNA测序技术 原理：当光照在一个物体上时，物体离光源越近，离成像面越远，则形成的影子越大，当DNA被光照后，可在光敏成像板上留下图像，通过比对可直接测定DNA序列。 组件介绍：1.光源需要条形光源，光源与高通透玻璃板之间要有金属通道，减少光能辐射递减 2.高通透玻璃板上含有固定DNA的芯片 3.光敏成像板为光敏变色材料 测序过程： dNTP的3‘羟基被化学方法保护 每轮合成反应只能添加一个碱基 测序过程： GenomeAnalyzer系统需要的样品量低至100ng，文库构建过程简单，减少了样品分离和制备的时间，配对末端读长可达到2×50bp，每次运行后可获得超过20 GB的高质量过滤数据，且运行成本较低，是性价比较高的新一代测序技术。 小结 2.3 SOLiD技术 SOLID通过连接反应进行测序。其基本原理是以四色荧光标记的寡核苷酸进行多次连接合成，取代传统的聚合酶连接反应。具体步骤包括： 文库准备 扩增 微珠与玻片连接 连接测序 与454测序类似 SOLiD系统与454测序系统相比，每张玻片能容纳更高密度的微珠，在同一系统中轻松实现更高的通量。 测序过程： 连接酶 八聚核苷酸 模板 通用测序引物n 超高通量是SOLID系统最突出的特点，目前SOLID 3单次运行可产生50 GB的序列数据，相当于17倍人类基因组覆盖度。 小结 表1 三种二代测序技术对比 4. 第三代DNA测序技术 第二代的高通量测序技术已经得到了很好的发展和应用, 但是由于其测序速度、成本、准确度等关键问题的解决仍存在困难,研究者们很快将目光转向了更高更新的测序解决方案。 单分子测序也就应运而生。 2009年12月,中科院北京基因组研究所与浪潮成立“中科院北京基因组研究所—浪潮基因组科学联合实验室” 三代测序技术是以单分子测序为特点的测序技术 单分子即时DNA测序技术(SMRT) HeliScope单分子测序 基于荧光共振能量转移的即时DNA测序 纳米孔单分子测序技术 第三代测序技术 1、目前一期的读取速度为3bp/ s 2、它实现了DNA聚合酶内在自身的processivity（延续性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很长的片段），一个反应就可以测非常长的序列。 3、它的精度非常高，达到99.9999%。 标记荧光基因 DNA聚合酶作用 显微镜下进行荧光探测 零级波导的纳米结构来实现即时观察和背景荧光干扰 4.1 单分子即时DNA测序技术 零级波导的纳米结构 小孔的尺寸低于光的波长，小孔底部形成消逝波，创造很小体积的检测空间 DNA链周围游离的荧光标记dNTP有限，非常快速进出于小孔，稳定的背景荧光信号 荧光标记dNTP被掺入到DNA合成链，其携带的特定荧光会持续一小段时间(荧光光曝) DNA聚合酶 4.2 HeliScope单分子测序 优点：采用了一种新的荧光类似物和更加灵敏的监测系统，能够直接记录到单个碱基的荧光，从而克服了第二代测序必须用PCR扩增出数千个拷贝以增加信号亮度的缺陷。 DNA聚合酶 荧光标记的dNTP 产生荧光 CCD记录 发生了碱基延伸反应 平面基板模拟图 4.3 基于荧光共振能量转移的即时DNA测序 荧光供体 DNA聚合酶 荧光受体 4种dNTP 荧光共振能量转移具体过程 优点： 游离的dNTP不发光，只有其掺入到新合成的DNA链时才会发光，极大地降低了背景荧光干扰 此方法不需要用到持续的高能量的激发光照射，因此也能够极大地减少DNA聚合酶的光损伤作用，进一步延长了测序长度。 能量 DNA分子以一次一个碱基的速度依次通过纳米小孔,利用核酸外切酶的特性来识别出不同的DNA碱基 优点：纳米孔测序的优势在于它不需要对DNA进行标记，也就省去了昂贵的荧光试剂和CCD照相机。 4.4 纳米孔单分子测序技术 内部：核酸外切酶和环式糊精 由生物分子组成的纳米孔 优点： 直接测RNA序列。 既然DNA聚合酶能够即时观测，那么以RNA为模板复制DNA的逆转录酶也同样可以应用于第三代测序平台。 直接测甲基化的DNA序列。 SMRT技术也可利用甲基化碱基特有的荧光信号来识别模板DNA中的甲基化修饰，如N6·甲基腺苷、5．甲基胞嘧啶或5一羟甲基胞嘧啶