Clostridiumbutyricum蔗糖磷酸化酶的酶学性质及其功能研究.docx

? ? Clostridiumbutyricum蔗糖磷酸化酶的酶学性质及其功能研究* ? ? 谭姚姚，何贺贺，王宏萌，梁 蒙，林 宇，黄日波，杜丽琴** (1.广西大学生命科学与技术学院，广西微生物与酶工程技术研究中心，广西南宁 530005；2亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁 530005) 糖苷类化合物通常是指由单糖或多糖的半缩醛羟基与配体两部分缩合而成的含糖衍生物，配体可以是糖类，也可以是非糖类物质——蛋白质、脂肪醇等[1]。糖苷类化合物不仅可为生物体提供能量、调节植物的生长，而且在生产和生活中使用也非常广泛[2]。如在医药行业当中，环烯醚萜苷类化合物、芳香碳糖苷化合物、三萜苷类化合物等糖苷类化合物因具有极大的药理性价值，被用于治疗营养不良、中风等多种症状[3,4]。在化妆品行业，α-熊果苷是一种十分有效的美白成分，而甘油糖基化后生成的2-O-(α-D-glucopyranosyl) -sn-glycero是一种很好的保湿剂(Glycoin?)[5,6]。此外，烷基糖苷作为一类可降解、毒性低的优质非离子型表面活性剂被大家所熟知[7]。因此，具有极大应用价值的糖苷类化合物引起了人们的研究热潮。除了直接从自然界获取外，人们还可以使用多种方法来合成糖苷类化合物，如化学法、生物催化法等，通过对糖类或非糖类化合物糖基化修饰来形成新的糖苷键，从而合成糖苷类化合物。 蔗糖磷酸化酶主要存在于微生物体内，属于糖基水解酶GH13家族。除了能够水解蔗糖外，蔗糖磷酸化酶还具有催化糖苷键转移的作用[8,9]，因此它可以作为一种生物催化剂，将底物合成糖苷类化合物[10]。Wang等[11]利用蔗糖磷酸化酶合成曲二糖，使得益生元曲二糖得到了大规模的生产；对减轻过敏性皮炎症状有益的低聚糖——蜜二糖也可以通过蔗糖磷酸化酶来催化合成[5]；经过蔗糖磷酸化酶的作用，可以将苯二酚分子催化加上葡萄糖基，形成具有美白作用的熊果苷[12]。Gudiminchi等[13]利用蔗糖磷酸化酶对维生素C进行葡萄糖糖基化，使其不稳定性得到很大程度的改善。此外，蔗糖磷酸化酶还可对儿茶素[14]、白藜芦醇[15]、甜菊醇[16]、槲皮素[17]等进行转糖苷催化。因此，蔗糖磷酸化酶在转糖苷催化方面有较大的应用价值。目前，未有关于丁酸梭菌Clostridiumbutyricum中蔗糖磷酸化酶的相关报道，本研究对其酶学性质和转糖苷功能进行探讨，并进一步讨论不同来源的蔗糖磷酸化酶的差异性，以挖掘出具有利用价值的蔗糖磷酸化酶，提高其在工业应用中的潜力。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株与质粒 丁酸梭菌C.butyricumDSM10702、表达载体pQE30、感受态细胞Escherichia.coliXL1-blue等均由本实验室保存。 1.1.2 主要试剂和仪器 试剂：PrimerSTARTMHS DNA聚合酶、T4DNA 连接酶、dNTP、λ/Hind Ⅲ DNA marker、限制性内切酶BamH Ⅰ、PstⅠ等均购买自Takara(宝)生物股份有限公司；胶回收/PCR纯化试剂盒、质粒DNA提取试剂盒以及纯化试剂盒均购自Fluxion Biosciences公司；蔗糖购自生工生物工程(上海)股份有限公司；葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)、儿茶素等购买自上海源叶生物科技有限公司。 仪器：PCR仪(T-Gradient Thermoblock、MJ Reserch PTC-2000，苏州亚凡生物技术有限公司)，离心机(Eppendorf Centrifuge 5415D，上海智岩科学仪器有限公司)，高效液相色谱仪(Agilent G1314F，杭州瑞析科技有限公司)，隔水式恒温培养箱(Binder，上海齐欣科学仪器有限公司)，恒温振荡摇床(ZHWY-211B，上海知楚仪器有限公司)。 1.2 方法 1.2.1 蔗糖磷酸化酶基因的克隆 通过对高通量全基因组从头测序丁酸梭菌的结果分析，查找糖基水解酶13家族中被注释为蔗糖磷酸化酶的核苷酸序列，并对丁酸梭菌的蔗糖磷酸化酶基因所编码的蛋白质进行结构组件分析，充分了解其结构，然后利用软件Vector NTI Advance 11.5进行引物设计，所设计的引物序列如下(其中下划线表示酶切位点)： cbsp-F：5′-CTCGGATCCGATAAGATAAAA- AATGAAATAATG-3′； cbsp-R：5′-CTACTGCAGCTCAATAGTAAA- ATCATAACTCTT-3′。 PCR程序：98℃ 3 min；98℃ 15 s，56.5℃ 10 s，72℃ 110 s，30个循环；72℃ 10 min。将PCR扩增所得的DNA片段及提取的质粒pQE30分别经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切处理后，