微生物学实验技术(研究生) .pdf

微⽣物学实验技术（研究⽣） ⾷品微⽣物实验技术讲义 （硕⼠研究⽣⽤） ⾷品科学与⼯程学院 微⽣物学实验技术的体系 具有独特性：需要独特的实验室装备和独⽴的训练 技术包括：显微镜术和制⽚染⾊技术、⽆菌操作技术、消毒灭菌技术、纯种分离培养技术、合成培养基技术、选择性和鉴别性 培养基技术、深层液体培养技术、厌氧培养技术、菌种保藏、复壮技术、菌种选育技术等。 第⼀章微⽣物的纯培养和显微技术 计划学时：2 重点：微⽣物的分离和纯培养技术，常⽤的菌种保藏⽅法。细菌、放线菌、霉菌、酵母菌等的形态特征。 ⼤多数动物植物的研究、利⽤都能以个体为单位进⾏，⽽微⽣物由于个体微⼩，在绝⼤多数情况下都是利⽤群体来研究其属 性，微⽣物的物种（菌株）⼀般也是以群体的形式进⾏繁衍、保存。在微⽣物学中，在⼈为规定的条件下培养、繁殖得到的微 ⽣物群体称为培养物（culture），⽽只有⼀种微⽣物的培养物称为纯培养物（pure culture）。由于在通常情况下纯培养物能 较好地被研究、利⽤和重复结果，因此把特定的微⽣物从⾃然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的纯培养技术是进⾏微⽣物 学研究的基础。相应的，微⽣物个体微⼩的特点也决定了显微技术是进⾏微⽣物研究的另⼀项重要技术，因为绝⼤多数微⽣物 的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进⾏观察和研究。显微技术包括显微标本的制作、观察、测定、分析及记录等⽅ ⾯的内容。实际上，正是由于显微技术及微⽣物纯培养技术的建⽴才使我们得以认识丰富多彩的微⽣物世界，并真正使对微⽣ 物的研究发展成为⼀门科学。 第⼀节微⽣物的分离和纯培养 ⼀、⽆菌技术 微⽣物通常是⾁眼看不到的微⼩⽣物，⽽且⽆处不在。因此，在微⽣物的研究及应⽤中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的 天然微⽣物群中分离出特定的微⽣物，⽽且还必须随时注意保持微⽣物纯培养物的“纯洁”，防⽌其他微⽣物的混⼊。在分离、 转接及培养纯培养物时防⽌其被其他微⽣物污染的技术被称为⽆菌技术（aseptic technique），它是保证微⽣物学研究正常进 ⾏的关键。 1. 微⽣物培养的常⽤器具及其灭菌 试管、玻璃烧瓶、平⽫ （culture dish，Petri dish）等是最为常⽤的培养微⽣物的器具，在使⽤前必须先⾏灭菌，使容器中不 含任何⽣物。培养微⽣物的营养物质 （称为培养基（culture medium））可以加到器⽫中后⼀起灭菌，也可在单独灭菌后加到 ⽆菌的器具中。最常⽤的灭菌⽅法是⾼压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的⽣物，包括最耐热的某些微⽣物的休眠体，同时可以基 本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器⽫也可采⽤⾼温⼲热灭菌。为了防⽌杂菌，特别是空⽓中的杂菌污染，试管及 玻璃烧瓶都需采⽤适宜的塞⼦塞⼝，通常采⽤棉花塞，也可采⽤各种⾦属、塑料及硅胶帽，它们只可让空⽓通过，⽽空⽓中的 其他微⽣物不能通过。⽽平⽫是由正反两平⾯板互扣⽽成，这种器具是专为防⽌空⽓中微⽣物的污染⽽设计的。 2. 接种操作 ⽤接种环或接种针分离微⽣物，或在⽆菌条件下把微⽣物由⼀个培养器⽫转接到另⼀个培养容器进⾏培养，是微⽣物学研究中 最常⽤的基本操作。由于打开器⽫就可能引起器⽫内部被环境中的其他微⽣物污染，因此微⽣物实验的所有操作均应在⽆菌条 件下进⾏，其要点是在⽕焰附近进⾏熟练的⽆菌操作，或在⽆菌箱或操作室内⽆菌的环境下进⾏操作。操作箱或操作室内的空 ⽓可在使⽤前⼀段时间内⽤紫外灯或化学药剂灭菌。有的⽆菌室通⽆菌空⽓维持⽆菌状态。 ⽤以挑取和转接微⽣物材料的接种环及接种针，⼀般采⽤易于迅速加热和冷却的镍铬合⾦等⾦属制备，使⽤时⽤⽕焰灼烧灭 菌。⽽移植液体培养物可采⽤⽆菌吸管或移液枪。 接种① ⽤左⼿⼤拇指、⾷指和⽆名指夹住菌种试管和待接种的斜⾯试管，管⼝并齐，并使斜 ⾯向上成⽔平状态。右⼿拧松棉塞，但不要取下。 接种② 右⼿拿接种环（如握钢笔），在⽕焰上烧灼灭菌。注意：有可能伸⼊试管内的接种环其余部分也要烧灼，特别是箍处。 接种③ 在⽕焰边⽤右⼿⽆名指和⼩指夹住两个棉塞，将它们取下（不能放下）。同时左腕转动，烧灼管⼝⼀周，勿烧得过烫。注意： 不要将酒精灯碰翻，以免烧伤。 接种④ 将接种环伸⼊试管内，让环先接触培养基上未长菌的部位，使环冷却。然后，轻轻挑取少量菌体，⽴即将接种环抽出。 接种⑤ 在⽕焰旁迅速将沾有菌体的接种环伸到斜⾯培养基的底部，由⾥向外轻轻划蛇形细线，线要划密⼀些。注意不要将培养基划 破，也不要使接种环接触到管壁或管⼝ 接种⑥ 抽出接种环，再⽤⽕焰烧灼管⼝，并在⽕焰上⽅将棉塞塞上。将接种环在⽕焰上烧红 灭菌，接种致病菌时更要注意这点。将棉塞旋紧。注意：棉塞与⽕焰的距离要适当，以免棉