原代细胞培养和死活细胞鉴别血球计数实验.doc

PAGE 3 【实验目的】 了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。 学习细胞计数、营养液的配制等，初步掌握无菌操作方法。 3、了解细胞损伤的过程及死活细胞的鉴定方法。 【实验原理】 (一) 细胞原代培养 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 (二) 细胞死活鉴定 在显微镜下活细胞细胞膜完整、立体感强，胞质透明度好，颗粒状物质少；死细胞膜破裂，无立体感，细胞通透性差，有颗粒状物质、空泡。 培养好的细胞培养液颜色呈土黄色，透明度好，不浑浊，发亮，有浑浊可能是污染初期或细胞太多。 染色排除法是生物研究中判断细胞活性的一种常用 方法，简便，易于操作实验是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异来进行的。原理：因为活 细胞的细胞膜具有选择透过性，细胞不需要的物质通常不能进入细胞，染色剂中如台盼蓝就不能进入细胞，因此用该染色剂处理细胞后，细胞不会被染色，由于死细胞的细胞膜是全透性的，因此台盼蓝能进入死细胞，从而可以使死细胞染色。依此 染色便可以判断细胞的 活性。 活细胞必需通过控制物质进出细胞膜来保持内部生理环境的稳定性。细胞死后，细胞膜通透性发生改变，原先不能进入细胞的物质也能够进入细胞。常见的细胞燃料有：中性红、台盼蓝、甲基蓝、美蓝、荧光素双醋酸酯等。台盘蓝染料正常情况下被活细胞阻拦在细胞膜外，只有细胞膜受损或者细胞死亡后，才能进入细胞，从而与解体的DNA结合，使其着色，因此，活细胞一般不能被台盘蓝染色，而死细胞会被染成蓝色。通过显微镜很容易就能识别出死亡被染色的细胞，并可用细胞计数板进行计数。伊红和苏木精是最常用的细胞染色剂。伊红在很多生物技术中都有应用。伊红有自发荧光特性。悬液中细胞的精确计数，往往采用血细胞计数器。 荧光排除法 生活力强的细胞能发出强烈的黄绿色荧光；生活力的细胞发出荧光也较弱；死亡细胞无荧光。 【实验器材】 解剖剪，解剖镊，棉球，培养皿，酒精灯，75%酒精，移液枪，无菌操作台，培养箱，正置光学显微镜，倒置光学显微镜，吸管，解剖盘，滴管，离心管，离心机，注射器，塑料培养皿，载玻片，盖玻片，血细胞计数板等。 【实验材料】 小鼠1只，细胞培养液（含生长因子），Trypen Blue染液，PBS缓冲液 【实验步骤】 (一) 细胞的原代培养 1. 取材： 取小鼠一只，采用断头法处死。清水洗小鼠浸入75%酒精中消毒3min，取出转入超净工作台内的解剖盘中，无菌操作打开腹腔，取出其脾脏，除去其周围的脂肪组织，并用PBS液自上而下淋洗1-2次，转入无菌培养皿中待用。 2. 分离脾细胞： 用滴管向培养皿中注入30滴PBS缓冲液，再用’L’型针头注射器在皿中吸取0.2毫升PBS液注入脾脏，注射时沿长轴注射。然后再用针头在脾脏上扎眼，并用’L’型针头轻轻刮出脾细胞。在均匀吹匀脾脏细胞。 吸取上述分离的单个脾细胞悬液，放入Eppendorf管中，使量至1mL，以1000r/min离心5min。 3. 培养脾细胞： 取塑料培养皿一套，用移液枪吸取培养液2mL加入塑料皿中，并将皿标记待用。取离心后的Eppendorf管，弃去上清液，用移液枪（200ul）吸取塑料皿中的培养液400ul加入弃去上清的Eppendorf管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，吸取200ul脾细胞悬液接种于上述塑料皿中，混匀后放入37°C，5%CO2的培养箱中培养。 (二) 细胞死活鉴定及计数 1. 试剂配制：用生理盐水配成4%Tyrpen Blue染液，备用。 2. 染色计数： 取0.5mL细胞悬浊液放入试管中，加入1-2滴染液。混合。2min后将细胞放在血细胞计数板上观察死活情况。 3. 计数： 在10x10倍的显微镜下观察，计算血细胞计数板的中间方格四角和中间5个小方格的细胞数量。包括细胞总数与死细胞数量。压线者计上不计下，计左不计右。 4. 计算细胞活力： 根据公式： 活细胞率（%）={（细胞总数—死细胞数）\细胞总数}*100% 【实验结果】 Tyrpen Blue染液，活细胞不会被染色而呈无色，死细胞会被其染色而呈蓝色。 显微镜下观察结果： 表格 计算结果： 死细胞 个\ml 活细胞 \ml 活细胞率 % 死细胞率 % 细胞活力 % 【注意事项】