DNA提取实验报告-XIANG.doc

DNA Isolation 一、目的 1.掌握動物組織中DNA提取的原理和操作過程 2.瞭解DNA的組分，掌握DNA的定性檢測的具體方法 3.掌握DNA純度檢測和濃度測定方法 二、原理 蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）存在下保持很高的活性。在勻漿後提取DNA的反應體系中，SDS可破壞細胞膜、核膜，並使組織蛋白與DNA分離，EDTA則抑制細胞中Dnase的 活性；而蛋白酶K可將 蛋白質降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來。 氯仿-異戊醇溶液可以使核蛋白變性沉澱，將核酸物質萃取出來；再向萃取液中加入適量乙醇，可使DNA析出。氯仿異戊醇抽提和乙醇沉澱方法在DNA純化研究中非常常用，氯仿-異戊醇抽提的原理是，氯仿可使蛋白質變性並加速有機相與液相分層；異戊醇有助於消除抽提過程中產生的氣泡。而DNA不溶於乙醇等有機溶劑，因此可以通過乙醇沉澱來純化和濃縮DNA。 三、材料、藥品 1．臺式離心機；紫外分光光度計；一次性塑膠手套。 2．Pipetman（1000μL,200μL，20μL）；Tip（1000μL,200μL/20μL）。Tip頭盒（1000μL,200μL/20μL）；Eppendorff管（1.5mL）。 3．DNA提取的相關試劑： 1）Protein K。2）Extraction buffer:SET solution。 3）EDTA。 4）SDS。 5）Phenol Extraction。 6）Phenil/chloroform(1:1) 7）Chloroform/isoamylalcohol（24:1） 8）100% ethanol 9）70% ethanol 10）TE buffer 四、步驟 1.破碎細胞膜體系（準備工序） 1）組織（0.1g-0.5g）放於eppendorf中 2）加入500μLSET buffer，50μL proteinase K水浴55℃過夜。 Proteinase K disrupt the cell membrane and protect DNA from degradation(high activity in EDTA and SDS exsiting environment) Tris buffer provide an stable base environment EDTA chelate bivalent ions(Mg2+ bind to anionic phosphate group), inhibit DNase and electrostatic interaction of DNA-basic histone SDS bind to protein give more anionic charge to separate DNA and histone, denature DNase and other proteins High salt reduce ionic interaction of DNA-cations 2.在特定條件下純化分離（實驗工序） 1）加入500μL phenol,shake 3min,離心12000rpm 3min Phenol dissociate protein form nucleic acid, after centrifuge organic phenol phase carrying the protein, while DNA exist in the aqueous phase 2）取上清液到新eppendorf中，加入500μLphenol/chloroform(1:1),shake 2min,離心12000rpm 3min Chloroform improve the efficiency of nucleic acid extraction denatrue protein assist DNA-protein separate enhance separation of the phases, facilitate remove aqueous phase remove lipid 3）取上清液到新eppendorf中，加入500μLchloroform/ iso-amyl alcohol(24:1)，shake離心12000rpm 3min To denature and precipitate protein by lowering the dielectric constant of aqueous medium, precipitated material is removed by centrifugation, decrease the bu