实验6 动物肝脏中DNA的提取.doc

PAGE 1 实验六：动物肝脏中DNA的提取及定量测定 一、实验目的 1、学习和掌握用浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术。 2、了解常见生化组分提取技术。 3、学习和掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。 二、实验原理 核酸和蛋白质在生物体中以核蛋白的形成存在，其中DNA主要存在于细胞核中，RNA主要存在于核仁及胞质中，在制备核酸时应防止过酸、过碱及其他能引起核酸降解的因素的作用。全部操作过程应在低温下(4℃)进行，必要时还要加入酶抑制剂。如柠檬酸、氰化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸(EDTA)等可以抑制DNA酶活性，皂土可抑制RNA酶活性，同时SDS或苯酚等蛋白变性剂也可使核酸降解酶破坏。 动植物的DNA核蛋白能溶于水及高浓度的盐溶液(如1mol/L NaCl)，但在0.14mol/L的盐溶液中溶解度很低，而RNA核蛋白则溶于0.14mol/L盐溶液，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。 将抽提得到的脱氧核糖核蛋白用SDS(十二烷基硫酸钠)处理，DNA即与蛋白质分开，可用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。向含有DNA的水相中加入冷乙醇，DNA即呈纤维状沉淀出来。 DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成w-羟基-r-酮基戊醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物(λmax=595nm)。 DNA(脱氧戊糖基) [H+] HO-CH2-C(=O)-CH2-CH2-CHO 二苯胺 蓝色化合物 在DNA浓度为20~200μg/ml范围内，吸光度与DNA浓度成正比，可用比色法测定。 三、实验器材 猪肝，分光光度计（595nm），比色杯，匀浆器，量筒（50ml、10ml），离心机(5000r/min)，离心管，试管及试管架，移液管（1.0ml、2.0ml、5.0ml），恒温水浴锅 四、实验试剂 氯化钠，柠檬酸钠，95%乙醇，SDS，氯仿，异戊醇，二苯胺试剂，DNA标准溶液（200μg/m1），二苯胺试剂等。 五、实验操作 1、配制溶液： 0.1mol/L NaCl-0.05mol/L柠檬酸钠溶液（2.925g氯化钠，20.85g柠檬酸钠，溶解于500mL蒸馏水）。 氯仿-异戊醇混合液：按照体积比20:1配制500mL。 5％SDS溶液：10g SDS溶于200ml水中。 二苯胺试剂：称取纯二苯胺（如不纯，需在70％乙醇中重结晶2次）5克溶于500ml分析纯的冰醋酸中，再加入50ml过氯酸(A.R，60％以上)，混匀待用。当所用药品纯净时，配得试剂应为无色。临用前加入5ml 1.6％乙醛溶液(乙醛溶液应保存于冰箱中，一周内可使用)，贮于棕色瓶。 2、称取猪肝2g，用匀浆器磨碎(冰浴)，加入4ml的0.1mol/L NaCl-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液，研磨三次，然后倒出匀浆物，匀浆物在4000r/min下离心10min，弃上清；沉淀中再加入6ml缓冲液，于4000r/min离心10min；取沉淀。 3、在上述沉淀中加入10ml 0.1mol/L NaCl-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液、5ml CHCl3-异戊醇混合液、1ml 5％SDS，振摇15min，然后缓慢加固体NaCl，使其终浓度为1mol/L(约0.9g)。将上述混合液在3500r/min离心15-20min，取上清水相。 4、在上述水相溶液中加入等体积冷95％乙醇，边加边用玻璃棒慢慢搅动，将缠绕在玻棒上的凝胶状物用滤纸吸去多余的乙醇，即得DNA粗品。将DNA粗品溶于10ml蒸馏水，待测。 5、标准曲线的绘制 按下表加入各种试剂，混匀，于60℃恒温水浴保温45min，冷却后，在595nm波长下，于722型分光光度计上比色测定，以吸光度对DNA浓度作图，制定标准曲线。 试管号 0 1 2 3 4 5 标准DNA溶液/ml 蒸馏水/ml 二苯胺试剂/ml 0.0 2.0 4.0 0.4 1.6 4.0 0.8 1.2 4.0 1.2 0.8 4.0 1.6 0.4 4.0 2.0 0.0 4.0 A595nm 6、样品的测定吸取DNA样液1.0ml，加入蒸馏水1.0ml，混匀。然后准确加入二苯胺试剂4.0ml，混匀，于60℃恒温水浴保温45min，冷却后，选595nm波长，于722型分光光度计上比色测定，根据所测得的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量(μg)。 7、计算猪肝中DNA含量： w= m1/m2×100% 式中w：DNA的质量分数(％)；m1：样液中测得的DNA的质量(μg)；m2：样液中所含样品的质量(μg)。