医学免疫学：检测组织细胞中蛋白表达的方法.ppt

检测组织细胞中蛋白表达的方法 酶联免疫吸附试验（ELISA） 免疫组织化学技术（IHC） 免疫沉淀（IP） 免疫印迹（Western blot） 酶联免疫吸附试验（ELISA） 为酶免疫测定技术的主要形式。是将抗原抗体反应的高度特异性和酶的催化放大作用相结合，发展建立的一种非放射性免疫标记分析方法。 免疫组织化学技术（IHC） 用标记的特异性抗体对组织切片或标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究的技术。 几种常见的方法： 免疫荧光法 免疫酶标法 免疫胶体金技术 免疫沉淀（IP） 利用抗原抗体特异结合的特性， 应用特意识别靶蛋白的抗体来 分离、检测细胞或组织中的靶 蛋白的方法。 关键步骤： 细胞裂解 裂解过程中，不但要大量释放细胞内蛋白，还要尽可能保证蛋白的完整性。因此通常要加去污剂（破坏细胞膜磷脂双层结构，能使膜蛋白进一步释放出来溶解）和蛋白酶抑制剂（抑制裂解后细胞提取物中蛋白酶活性）。 免疫沉淀抗原抗体复合物 抗原抗体可先形成复合物，然后再与树脂结合；或者抗体先与树脂结合，然后再与抗原形成复合物沉淀。免疫沉淀所选用的树脂为结合了A蛋白或G蛋白的亲和树脂。抗体Fc段与A或G蛋白的结合能力不同。 免疫印迹（Western blot） 在蛋白质凝胶电泳和固相免疫分析基础 上建立的一种蛋白质多参数检测技术。基本 原理是通过特异性抗体与凝胶电泳分离的目 标蛋白质抗原的反应，分析抗体结合的位置 和抗体结合量，进而确定特定蛋白质抗原分 子在细胞或组织中的表达情况。 一、蛋白质抗原电泳分离 （一）、样本处理 1、体外培养细胞蛋白质样本的制备 2、组织蛋白质样本的制备 3、蛋白质定量和保存 （二）、凝胶浓度选择及配制 （三）、蛋白标准品的选择 （四）、电泳 二、蛋白质的转膜 1、湿式电转印 2、半干式电转印 三、抗体杂交 （一）封闭 （二）抗体杂交 四、检测 1、辣根过氧化物酶-ECL法 2、辣根过氧化物酶-DAB法 酶联免疫吸附试验（ELISA） 灵敏度高、特异性强、稳定、操作简捷、快速、无污染等。应用最广泛。但只能定量。 免疫组织化学技术（IHC） 特异性强、灵敏度高、定位准确，可研究目的蛋白的运动。不适合定量。 免疫沉淀（IP） 研究目的蛋白的理化特性。可用来蛋白纯化、去除目的蛋白优化免疫印迹效果、测定蛋白修饰位点信息、测定蛋白降解速度、测定酶活。 免疫印迹（Western blot） 灵敏度高、特异性强、也可以测目的蛋白的相对分子质量和免疫学活性。但不能定位和精确定量。 丽春红（Ponceau S）也称猩红，可以用于PVDF膜、硝酸纤维素膜和醋酸纤维素膜上的蛋白的检测。丽春红带负电荷，可以与带正电荷的氨基酸残基结合，同时丽春红也可以与蛋白的非极性区相结合，从而形成红色的条带。丽春红对蛋白的染色是可逆的，染色后可以用蒸馏水，PBS或其它适当溶液洗去。因此，蛋白质N端测序时将SDS胶上的蛋白转移到PVDF膜，用丽春红染色后将目的条带切下用于测序。 * 丽春红（Ponceau S）也称猩红，可以用于PVDF膜、硝酸纤维素膜和醋酸纤维素膜上的蛋白的检测。丽春红带负电荷，可以与带正电荷的氨基酸残基结合，同时丽春红也可以与蛋白的非极性区相结合，从而形成红色的条带。丽春红对蛋白的染色是可逆的，染色后可以用蒸馏水，PBS或其它适当溶液洗去。因此，蛋白质N端测序时将SDS胶上的蛋白转移到PVDF膜，用丽春红染色后将目的条带切下用于测序。 *