不同细胞裂解液对bicinchoninecbca法和bradman法的影响.docxVIP

不同细胞裂解液对bicinchoninecbca法和bradman法的影响 在蛋白质组的研究中，优质细胞蛋白样本的制备和精确定量是确保研究结果的重要关键。在细胞蛋白的制备中,裂解液起到关键的作用,不同的裂解液,细胞蛋白的得率不同,而且在蛋白定量时,裂解液成分对蛋白定量方法的影响也不同。蛋白定量的常用方法主要有Bradford法、BCA法、Lowry法、双缩脲法、紫外分光光度法和凯氏定氮法等。其中,Bradford法和BCA法是蛋白质组学研究中最常使用的两种定量方法。 Bradford法是Bradford于1976年提出的,即考马斯亮蓝染色法,其原理是染料考马斯亮蓝与蛋白质分子的疏水区结合。考马斯亮蓝G250最大吸收峰在465 nm,当它和蛋白结合形成复合物时,其最大吸收峰改为595 nm,在一定蛋白质浓度范围内,吸收峰值的大小与蛋白质含量呈线形关系,以此来定量溶液中的蛋白质。BCA(bicinchoninic acid)法是20世纪80年代中期研制的一种改进的Lowry测定法,其原理是在碱性条件下蛋白质的酰胺键与Cu2+反应中生成的Cu+与BCA结合,形成的复合物在562 nm处有最大吸收峰,在一定蛋白质浓度范围内,光吸收强度与蛋白质浓度成正比。但这两种方法均会受到裂解液成分的影响,如:去污剂CHAPS、SDS和Triton X-100等可提高Bradford法的定量值;还原剂DTT、螯合剂EDTA和EGTA等可分别提高和降低BCA法的定量值。 荧光差异双向凝胶电泳(two-dimensional differential in-gel electrophoresis,DIGE)和传统双向凝胶电泳(two dimensional gel electro-phoresis,2DE)技术对样品的要求不同,需采用不同的裂解液配方。因此,本研究探讨了不同细胞裂解液对Bradford法和BCA法蛋白定量的影响,以期为后续的蛋白质组学研究提供合适的蛋白定量方法;同时,还分析了在蛋白质定量实验中反复冻融、不同比色杯以及不同时间的标准曲线等对蛋白质定量结果的影响。 1 bsa活性测定 1.1实验材料 1.1.1主要试剂: 牛血清白蛋白(生物工程上海有限公司),考马斯亮蓝G-250(国药集团化学试剂有限公司),BCA TM Protein Assay Kit(PIERCE,USA),标准BSA溶液(PIERCE,USA)。其余试剂均来自Bio-Rad,USA。石英比色杯(Bio-Rad,USA),塑料比色杯(Bio-Rad,USA)。 1.1.2溶液配制: DIGE裂解液:7 mol/L Urea,2 mol/L Thiourea,4% CHAPS,30 mmol/L Tris,罗氏蛋白酶抑制剂,HCl调pH值至8.5;2DE裂解液A:7 mol/L Urea,2 mol/L Thiourea,4% CHAPS,2% IPG buffer pH 3~10,65 mmol/L DDT,罗氏蛋白酶抑制剂;2DE裂解液B:8 mol/L Urea,4% CHAPS,40 mmol/L Tris,60 mmol/L DDT,1 mmol/L EDTA,1 mmol/L EGTA,罗氏蛋白酶抑制剂;2DE裂解液C:8 mol/L Urea,4% CHAPS,40 mmol/L Tris,65 mmol/L DDT,2% IPG buffer pH 3~10,罗氏蛋白酶抑制剂。样品BSA溶液:准确称量BSA干粉,分别由双蒸水、DIGE裂解液和3种2DE裂解液配制成浓度为0.5 mg/ml的溶液。考马斯亮蓝溶液:考马斯亮蓝G-250(10%,M/V),95%乙醇(5%,V/V),磷酸(10%,V/V),过滤后,4 ℃棕色瓶保存。 1.1.3细胞种类: 人乳腺癌细胞MCF-7(DIGE裂解液,2DE裂解液A),小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3(2DE裂解液B),人羊膜细胞FL(2DE裂解液C)。 1.1.4主要设备: SmartSpec 3000分光光度计(Bio-Rad,USA),酶标仪(infinite M200,TECAN,Switzerland),旋转振荡仪(Bio-Rad,USA)。 1.2实验方法 1.2.1Bradford法标准曲线制作: 分别取一定体积的浓度为0.5 mg/ml的标准BSA溶液于eppendorf管中,加0.15 mmol/L NaCl溶液至100 μl以配制成如下浓度梯度的BSA溶液:0 mg/ml、0.025 mg/ml、0.05 mg/ml、0.075 mg/ml、0.1 mg/ml、0.2 mg/ml,最后加900 μl考马斯亮蓝溶液,旋转混匀5 min后分光光度计上595 nm处读数。样品定量时,用0.15 mmol/