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1 高效液相色谱法( HPLC ) 一、 方法原理 1、液相色谱法概述 高效液相色谱分析法 2 其工作流程为：高压输液泵将贮液器中的流动相以稳定的流速(或者压力)输送至 分析体系， 在色谱柱之前通过进样器将样品导人， 流动相将样品挨次带入预柱、 色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并挨次随流动相流至检测器，检测到的信 号送至数据处理系统记录、处理和保存。 3 HPLC 仪器的基本结构 2、高效液相色谱法的特点( HPLC )与经典柱色谱原理相同，是由液体流动相将被分离混合物 2、高效液相色谱法的特点( HPLC ) 4 配系数、离子交换作用或者份子尺寸大小的差异来进行分离。 由于高压输液泵、高灵敏度检测器和高效固定相的使用， 提高了柱效率，降低了检出限，缩短了分析时间。 特点是选择性高、分离效能高、分析速度快的特点 特点是选择性高、分离效能高、分析速度快的特点。 高沸点有机物的分析、离子型化合物、高份子化合物、热 稳定性差的化合物以及具有生物活性的物质，弥补了气相色谱 法的不足。 高效液相色谱法与气相色谱法相比， 各有所长， 互相补充。 如果能用气相色谱法分析的样品，普通不用液相色谱法， 因为气相色谱法分析速度更快、更方便、成本更低。 3、高效液相色谱法的固定相和流动 3、高效液相色谱法的固定相和流动相 ( 1 )固定相 表面多孔型和全多孔型两大类。 ( ( 2 )流动相(淋洗液) 流动相的选择对改善分离效果产生重要的辅助效应。 从实用， 选用的流动相具有便宜、易购的特点外，还应满足下列 要求： ① ② ③ ④ ⑤ 与固定相互不相溶，并能保持色谱柱的稳定性。 高纯度，以防所含微量杂质在柱中积累，引起柱 性能的改变。 与所用的检测器相匹配。 应对样品有足够的溶解能力，以提高测定的灵敏 度。 具有低的黏度(可减少溶质的传质阻力，提高柱 效)和适当低的沸点。 5 ⑥ 应避免使用具有显著毒性的溶剂，以保证工作人 员的安全。 液相色谱法中 液相色谱法中常用的流动相有正己烷、正庚烷、甲醇、乙腈等。 4、高效液相色谱法的主要类型 ( ( 1 )液 — 固吸附色谱法 ①分离原理：基于各组分吸附能力的差异来进行混合物分离的。 ②固定相：极性和非极性两种。 极性固定相：硅胶、氧化镁。 非极性固定相：多孔微粒活性炭、多孔石墨化炭黑。 ③流动相：基本原则：极性大的试样用极性较强的流动性；极 性小的试样用极性较低的流动性。 液— 固吸附色谱法合用于分离具有中等相对份子质量的非极 性或者非离子型的油样品；分离异构体；但不合用于分离同系物。 ( ( 2 )液 —液分配色谱法 ①分离原理：利用混合物中各组分在固定相和流动相中溶解度 的差异来进行分离的。 6 ②正相与反相液-液分配色谱： 正相液—液色谱分离：流动相的极性小于固定液的极性。固定 相为极性组分，流动相为非极性溶剂。合用于极性组分的分离。 反相液—液色谱分离：流动相的极性大于固定液的极性。固定 相为非极性组分，流动相为极性溶剂。合用于非极性组分的分离。 ③固定相：固定液涂在载体上或者微球吸附剂上。 ④流动相 ( ( 3 )凝胶色谱法(份子排阻色谱法) 根据所用流动相的不同，凝胶色谱法可分为两类： 凝胶过滤色谱法： ( GFC )用水溶剂作流动相。 凝胶渗透色谱法： ( GPC )用有机溶剂四氢呋喃。 凝胶色谱法主要用来分析高份子物质的份子量分布，以鉴定高 份子聚合机理，选择聚合工艺及条件，并考察聚合材料在加工和使 用过程中份子量的变化。 二、 二、高效液相色谱仪 1 1、仪器基本构造 7 先做一个个单元组件，然后根据需要将各个单元组件组合起来。 最基本的组件是高压输液系 最基本的组件是高压输液系统、进样器、色谱柱、检测器和工作站 ( (数据处理系统)。 可根据需要配置自动进样系统、预柱、流动相在线脱气装置和自动 控制系统等。 下图是典型 HPLC 系统的结构示意图 ( ( 1 ) 仪器工作流程： 高压输液泵将储液器中的流动相以稳定的流速( 高压输液泵将储液器中的流动相以稳定的流速(或者压力)输送至 分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品 分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导入，流动相将样品依 次带入预柱、色谱柱 次带入预柱、色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并挨次随流动相 流至检测 流至检测器，检测到的信号送至工作站记录、处理和保存。 8 ( ( 2 ) 流动相净化装置 A. A. 过滤： 9 原因是防止不溶物阻塞流路或者色谱柱。 方法是用 0.45 μL 以下微孔滤膜(有机溶剂或者水)过滤。 B B. 脱气： 原因是溶解有氧气或者混入了空气而形成气泡，会使色谱图上 浮现尖锐的噪声峰；气泡变大进入流路或者色谱柱时会使流动相的流 速变慢或者不稳定，导致基线起伏。 方法有超声波震荡脱气、