土壤蔗糖酶活性测定方法.docx

PAGE1 / NUMPAGES1 土壤蔗糖酶活性测定 1.原理 采用3,5-二硝基水杨酸比色法。该方法以蔗糖为基质，基质在土壤蔗糖酶作用下生成葡萄糖，葡萄糖和3,5-二硝基水杨酸反应生成橙黄色的3-氨基-5-硝基水杨酸，并在508nm波长下有最大吸光值。 2.测定方法 ①称取壤土0.15g、砂土0.3g、粘土0.1g风干土于10mL离心管中，加入0.06 mL甲苯和1mL ph5.5磷酸缓冲液，再加3mL 8%蔗糖溶液，摇匀后加盖，放进36~37℃的培养箱中进行培养24个小时； ②培养完成后取出，摇匀，并于4000r/min离心5min； ③取上层清液0.2ml于20ml玻璃管中，并加入0.5ml3,5-二硝基水杨酸，再立即将玻璃管沸水浴中加热5min，加热完毕后在自来水流下冷却3min； ④将显色液体用蒸馏水稀释到5ml，在508nm波长下比色，记录吸光值。 3.蔗糖酶标准曲线的测定方法 （1）葡萄糖标准溶液的配制 a.饱和苯甲酸溶液的配制 在洁净的烧杯中加入适量蒸馏水，慢慢加入少量苯甲酸同时用玻璃棒搅拌，直至苯甲酸溶解的同时出现析出的苯甲酸晶体为止。 b.标准葡萄糖溶液的配制 称取500mg葡萄糖溶解于适量苯甲酸饱和溶液中，并取100ml容量瓶用苯甲酸饱和溶液定容（5mg/ml）。 （2）.操作步骤 a.取11支洁净20ml玻璃管编号0—10。 b.按下表加液 编号：0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10葡萄糖母液（ml）0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07饱和苯甲酸（ml）0.2 0.195 0.19 0.185 0.18 0.175 0.17 0.16 0.15 0.14 0.13葡萄糖浓度（mg/ml）0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07吸光值（A508nm）0 0.05 0.117 0.227 0.31 0.392 0.49 0.666 0.839 1.006 1.176c.在玻璃管中各加入0.5ml3,5-二硝基水杨酸溶液，并立刻放入沸水浴中加热5min.加热后，立刻将玻璃管在流动自来水下冷却3min.冷却完毕后，用蒸馏水定容至5ml.d.将显色液在508nm波长下比色。 4.计算 蔗糖酶活性以24h后1g土壤中含葡萄糖的mg数表示。 葡萄糖(mg)=a×100 a—从标准曲线查得的葡萄糖mg数 100—换算系数